除硫菌劑的工業化生產條件研究與應用

楊 帆，孟章進，姜桂英，錢志鴻，王志明

(1.中國石化江蘇油田分公司工程技術研究院，江蘇 揚州，225009；2:江蘇省油氣微生物工程研究中心，江蘇 揚州，225009)

微生物人工培養和自然條件下的生理特性有很大的不同，影響合成代謝產物能力的因素也有相當大的差異，其中培養基對微生物的各種代謝活動的影響最為顯著［1-2］，培養基的成分對菌體生長繁殖、產物的生物合成、產品的分離及產品質量和產量都有重要影響，除此之外，溫度、pH 值、裝液量等操作條件也是影響微生物生長的因素［3-4］。因此，微生物培養條件的優化非常重要。N411 是一株高溫除硫菌，為提高該菌的培養效能，提高發酵水平，從溫度、pH 值、搖瓶裝液量3 個因素著手，開展了工業發酵培養基和發酵條件研究。

1 材料與方法

1.1 發酵培養基優化

按照表1 的組成成分設計發酵培養基，比較不同配方條件下N411菌株的生長增殖情況，以確定合適發酵生產的培養基。

表1 發酵配方設計 g

1.2 檢測方法

比濁法:取一定量搖瓶液，稀釋不同倍數后，用紫外分光光度計測定波長為600 nm 的吸收值（OD600）。

平板菌落計數法:取搖瓶液1 mL，分別稀釋至10～5、10～6、10～8倍（由預試驗得出），取0.1 mL的稀釋菌液涂布于固體培養基平板上，培養1 d 后，計算搖瓶液中的活菌數。

細菌數（CFU/mL）=平板上菌落數×稀釋倍數／平板上加菌液的量（mL）。

pH 檢測:定期取樣，以4.0～9.0 精密pH 試紙檢測。

2 結果與分析

2.1 除硫菌的發酵培養基優化研究

2.1.1 發酵培養基碳源篩選

以XSN 為基本氮源，保持質量濃度10 g/L 和其他基礎培養基成分配比不變，分別設置2 g/L PTT、3 g/L YMF、1 g/L PTT +1.5 g/L YMF 作為不同碳源處理，調節培養基最終pH 為7.0，50℃培養并觀察菌體生長情況，明確不同碳源條件下除硫菌N411 的增殖影響。

以YMF 作為多糖部分或全部替代PTT 測定除硫菌N411 對多糖的分解利用能力（圖1）。試驗結果表明，2 g/L PTT 作為碳源培養條件下菌體生長較好，50℃培養16 h后菌體達最大濃度，1 g/L PTT+3 g/L YMF 的細菌繁殖量明顯低于20 g/L PTT 處理。以5 g/L YMF 替代PTT 的培養基中除硫菌N411繁殖速度慢，12 h 達最大高峰期，表明除硫菌N411 能有效利用PTT等單糖作為碳源，而對DF為碳源的多糖降解利用能力較弱，在試驗濃度范圍內，菌體增殖能力與培養基PTT濃度成正相關。

圖1 不同碳源培養基對除硫菌N411發酵培養的影響

2.1.2 發酵培養基氮源篩選

以PTT 為基本碳源，保持質量濃度2 g/L 和其他基礎培養基成分配比不變，分別設置4 g/L XSN、6 g/L 豆餅粉、2 g/L XSN+3 g/L 豆餅粉等不同氮源處理，調節培養基最終pH 為7.0，50℃培養并觀察菌體生長情況，明確不同氮源條件下除硫菌N411 的增殖影響（圖2）。

圖2 不同氮源培養基對除硫菌N411發酵培養的影響

在以2 g/L PTT 為碳源的基礎培養基中，以豆餅粉作為氮源部分或全部替代無機氮NaNO3，測定除硫菌N411 對有機氮的利用能力。試驗結果表明，4 g/L XSN作為氮源培養條件下菌體生長較好，50℃培養16 h 后菌體達最大濃度。2 g/L XSN+3 g/L 豆餅粉的處理中，細菌繁殖量明顯低于4 g/L XSN的氮源處理，且培養16 h 后菌體自溶，濁度下降。以6 g/L豆餅粉替代XSN作為氮源的培養基中，除硫菌N411幾乎不能繁殖生長，表明除硫菌N411 能有效利用XSN 等無機氮作為氮源，而對蛋白質為主要成分的豆餅粉作為有機氮源幾乎不能利用。在試驗濃度范圍內，菌體繁殖生長與XSN濃度成正相關。

2.1.3 發酵培養基優化

在明確除硫菌N411 適宜碳源、氮源基礎上，通過調整培養基中碳、氮比例對基礎培養基進行優化（見表1）。

培養基各組成成分的變化直接影響了除硫菌N411 的菌體生長。基礎培養基以PTT、XSN 為基本碳、氮源，能提供菌體發酵培養的一般需求，但發酵周期短，生長不整齊，16 h達最大OD600值，鏡檢呈現芽孢、孕孢及營養體多種菌體形態。通過對基礎培養基配方調整試驗表明，XSN 和PTT 是影響除硫菌發酵培養的關鍵營養因子，其含量和比例直接影響了菌體的發酵水平和發酵周期。在試驗范圍內，菌體生長量與XSN 含量成顯著正相關，同時PTT 含量也顯著影響除硫菌的生長。試驗結果表明配方1、配方2 都能獲得較高菌數的發酵培養液，培養44 h平板測定單位活菌數分別達6.6×107CFU/mL和2.1×107CFU/mL，可以在此范圍內優化發酵培養基以提高除硫菌N411的發酵水平。

圖3 除硫菌N411在不同組成培養基中的生長繁殖動態

2.2 除硫菌的發酵培養控制條件研究

2.2.1 不同溫度條件對除硫菌生長發育的影響

不同溫度條件試驗結果表明，除硫菌N411 的生長對溫度具有較高的要求，以50～60℃為宜。試驗在40℃條件下培養24 h，孢子幾乎不萌發。在60℃條件下培養孢子萌發率最高，平均達236 CFU/皿，隨溫度的提高，孢子萌發率有所下降（圖4）。從菌落生長速度來看，萌芽的菌體隨溫度的升高生長速度加快，以60℃溫度培養單菌落最多，說明60℃更適合菌體生長（圖5）。

圖4 不同溫度對除硫菌的孢子萌發的影響

圖5 不同溫度對除硫的菌落生長影響

2.2.2 不同pH值對除硫菌孢子萌發的影響

將培養基以1 mol/L HCl 或NaOH 調節pH 值分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5 和8.0 等不同酸堿度，按照方法接入1 mL 稀釋的孢子懸浮液，置于60℃生化培養箱中觀察培養，24 h 檢查培養基平板表面形成的菌落數，明確不同pH 條件對除硫菌N411孢子萌發的影響。

不同pH條件顯著影響除硫菌N411的孢子萌發（F=46.861，P=0.000）。pH 為4.0 的酸性條件下，孢子萌發受到顯著抑制，培養24 h 幾乎不萌發。在酸性條件下隨著pH 值的升高，孢子萌發率逐步提高，pH 值中性（pH 7.0）條件下達最大值，單位菌落數達237 個。堿性條件同樣抑制芽孢的萌發，pH 值大于8.0 以上孢子60℃培養24 h 幾乎不萌發。說明除硫菌適合在中性條件下生長（圖6）。

圖6 培養基不同pH值對除硫菌芽孢萌發的影響

2.2.3 不同裝液量對除硫菌生長狀況的影響

在50 mL 的滅菌的培養基中加入1 mL 除硫菌孢子懸浮液并充分搖勻。分別取4 mL、8 mL、12 mL加入15 mL 的指形管中，每處理重復6 次。以硅膠塞封口后，置于60℃、230 r/min 的搖床上震蕩培養。間隔4 h 分別取出不用裝液量的試管1 支，測定OD600值、pH值，并顯微鏡染色觀察細菌生長狀況。

不同裝液量直接影響了培養基中的溶氧濃度，進而影響好氧微生物的生長。裝液少，液體與空氣接觸面積大，溶氧量增加，反之則溶氧量減少。試驗結果表明，除硫菌N411 在不同溶氧條件下都能繁殖生長，但溶氧量的大小影響到菌體的生長速度，充足的溶氧量有利于芽孢的形成。4 mL/管裝液量生長發育速度快，整齊度高，12 h 達菌體最高濃度，OD600值達0.281，伴隨著芽孢形成，pH 逐漸上升，24 h 大部分芽孢脫落完成生長周期。隨裝液量的增加，菌體生長速度減緩，發育進度加長，12 mL/管裝液量24 h菌體形態仍處于營養體階段，pH值為7.0，未見芽孢形成（表2）。

表2 不同裝液量搖菌試驗對除硫菌N411菌體生長發育的影響

2.3 除硫菌工業發酵過程控制研究

2.3.1 除硫菌的發酵周期及菌體形態觀察

除硫菌在配方1 的培養基中，按照控制參數培養，24 h 完成發酵周期。接種后4 h，孢子萌發產生營養體并進行對數生長；接種后8 h 菌數顯著增多，處于對數生長后期，以營養體形態存在；接種12 h后細菌在營養體一端開始形成孢囊；接種后16 h，形成孢囊的菌體自溶并釋放出芽孢，20 h 后大部分芽孢脫落并聚集；24 h 后反應體系中主要以芽孢形式存在，脫落的芽孢二次萌芽生長（圖7）。

圖7 除硫菌N411在8M3發酵體系中菌體生長發育形態

終止培養取樣測定OD600值達2.327，顯著高于對照0.396 的OD600值，平板活菌數測定結果表明工業發酵生產的除硫菌N411 菌數達2.2×108CFU/mL（圖8）。

圖8 工業發酵除硫菌活菌數測定

2.3.2 除硫菌發酵過程pH值變化

伴隨著發酵過程進行，N411 反應體系的pH 值也隨之變化。接種時培養基pH 值為7.0，孢子萌發進入營養生長階段，培養4 h 后取樣檢測pH 值下降至6.5。隨著溶氧增加、蛋白質代謝增強，pH 逐步提高，接種后12 h pH 值升高到7.2。16 h后pH 上升至7.5，營養體形態的菌體開始形成孢囊，伴隨著細胞自溶，芽孢釋放，反應體系pH值上升為7.7（圖11）。

圖11 除硫菌N411在發酵培養過程中pH的動態變化

3 結論

（1）培養基的優化研究結果表明，在碳源選擇上，除硫菌N411 能有效利用PTT 等單糖作為碳源，而對DF 為碳源的多糖降解利用能力較弱。在氮源選擇上，除硫菌N411 能有效利用XSN 等無機氮作為氮源，而蛋白質為主要成分的豆餅粉作為有機氮源幾乎不能利用。

（2）N411 發酵控制條件以溫度、pH、裝液量（溶氧）為主要參數。通過實驗確定溫度為60℃，pH 值為7.0，裝液量為26.7%。

（3）采用制定的發酵工藝和控制條件完成了除硫菌N411 的工業發酵生產。所得發酵產品平板活菌數達2.2×108CFU/mL，且菌體整齊度高，無雜菌。