秋水仙堿片溶出度一致性評價*

李霞，閆富龍，柯寄明，方曉琳，陳衛東，2，3，4，5，彭燦，2，3，4

(1.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 230012；2.安徽省教育廳現代藥物制劑工程技術研究中心，合肥 230012；3.中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 230012；4.安徽省中醫藥科學院藥物制劑研究所，合肥 230012；5.安徽中醫藥大學藥物代謝研究所，合肥 230012)

秋水仙堿是一種典型的細胞有絲分裂毒素，結構中的C環與微管蛋白結合可阻止其聚合成紡錘絲，使細胞有絲分裂停止于中期。該藥屬于生物藥劑學分類系統(biopharmaceutics classification system，BCS)中的Ⅲ類藥物[1-3]，即高溶解、低滲透藥物，臨床主要用于治療痛風，治療家族性地中海熱和心包炎等也有效[4-7]。目前國內市場上生產秋水仙堿片仿制藥的廠家較多，不同廠家生產的同一制劑或同一生產廠家不同批號產品質量和療效可能存在一定差異。但文獻有關秋水仙堿片溶出度的研究筆者較少見到，且多局限于單一溶出介質，如水[8]。在多種溶出介質下溶出曲線測定已成為國內外評價固體制劑內在品質的重要手段，是提高仿制藥生物等效性實驗成功率的必經之路。筆者在本實驗以秋水仙堿為模型藥物，根據2015年版《中華人民共和國藥典》及文獻[8]，采用小杯法建立秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液和pH值6.8磷酸鹽緩沖液3種不同溶出介質中溶出方法，并采用f2相似性因子評價5個不同廠家秋水仙堿片溶出曲線相似性，以期為國內企業秋水仙堿片仿制藥質量一致性評價研究工作和處方工藝開發提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters ACQUITY Arc高效液相色譜儀系統(美國Waters公司，2489紫外檢測器，2424蒸發光散射檢測器)；YL-060數控超聲波清洗器(濟南巴克超聲波科技有限公司，360 W，40 Hz)；電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司，感量：0.01 mg)；ZRS-8L智能溶出實驗儀(天津天大天發科技有限公司)。

1.2試藥 秋水仙堿片樣品信息見表1。鹽酸、冰醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、氫氧化鈉均為分析純，實驗用水為超純水，甲醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1方法學考察

2.1.1色譜條件 參考2015年版《中華人民共和國藥典》及文獻[9-10]，色譜柱：Unitaryl C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm) ；流動相：甲醇-水(52：48)；檢測波長：254 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL。

2.1.2溶液的配制 ①對照品溶液的制備：精密稱取秋水仙堿對照品3 mg，置50 mL棕色量瓶，分別用相應溶出介質溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。②供試品溶液的制備：取秋水仙堿片，分別在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液以及pH值6.8磷酸鹽緩沖液3種溶出介質條件下實驗，取溶出液用孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.1.3專屬性考察 分別取對照品溶液、供試品溶液以及空白對照溶液，照“2.1.1”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果表明空白對照對測定無干擾，對照品溶液中的秋水仙堿峰與供試品溶液中的秋水仙堿峰保留時間相同，表明該方法專屬性良好。結果見圖1。

2.1.4線性關系實驗 精密量取對照品儲備液適量，分別用3種溶出介質稀釋，得到濃度約0.05，0.1，0.2，0.5，2.5和5.0 μg·mL-1秋水仙堿系列對照品溶液。精密量取秋水仙堿系列對照品溶液20 μL，照“2.1.1”項色譜條件進樣測定，以秋水仙堿濃度(X) 為橫坐標，峰面積(Y) 為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程見表2。結果表明，秋水仙堿在0.05～5.0 μg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.1.5精密度實驗 取“2.1.3”項對照品溶液，照“2.1.1”項色譜條件重復測定6次，結果3種介質中秋水仙堿峰面積的RSD分別為0.26%，0.77% 和0.62%，表明儀器精密度良好。

2.1.6穩定性實驗 取“2.1.3”項3種介質供試品溶液適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，12，24 h后，照“2.1.1”項色譜條件進樣測定，結果3種介質中秋水仙堿峰面積的RSD分別為為2.9%，1.6%和3.7%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.7加樣回收率實驗 取秋水仙堿片20片，研細，精密稱取適量(相當于秋水仙堿0.5 mg)置100 mL量瓶，加溶出介質適量，超聲使藥物溶解，定容。在已知濃度不同溶出介質的秋水仙堿溶出液中，分別加入相當于秋水仙堿含量80%，100%和120%的對照品，用相應溶出介質超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，過濾，即得3種不同濃度溶液，每個濃度平行制備3份，取續濾液按“2.1.1”項條件測定，結果見表3，表明方法回收率良好。

2.2溶出度測定

2.2.1溶出度測定方法 參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部溶出度測定方法小杯法(通則0931第三法)[11]，取本品12片，依次以水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液、pH值6.8磷酸鹽緩沖液200 mL為溶出介質，轉速為50 r·min-1，分別于 5，10，15，20，30，40，50，60，90，120，180 min 取樣1 mL，同時補加等量同溫溶出介質，以孔徑0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液進樣，記錄色譜圖，采用高效液相色譜(HPLC)法測定峰面積，計算溶出量，以時間為橫坐標，累積溶出百分率為縱坐標，繪制溶出曲線。

表1 秋水仙堿片樣品信息

a.對照品；b.供試品；c.空白對照品；1.秋水仙堿；A.水；B.pH值4.5醋酸鹽緩沖液；C.pH值6.8磷酸鹽緩沖液。

表2 回歸方程與線性范圍

表3 回收率實驗結果

累積溶出百分率：(RN%)=Mn/M標

Mn為累積溶出量(mg)，RN%為累積溶出百分率，V1為溶出介質體積，V2為每次取樣體積，Cn為第n個時間的溶出濃度，Ci為第i個點的溶出濃度，M標為秋水仙堿片標示量(mg)。

5個廠家不同批次秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液、pH值6.8磷酸鹽緩沖液3種溶出介質中的累積溶出曲線圖如圖2所示。

A、B.介質水；C、D.介質pH值4.5醋酸鹽緩沖液；E、F.介質pH值6.8磷酸鹽緩沖液。

式中Rt與Tt分別代表受試制劑與參比制劑在時間點t時的累積溶出百分率，n為取樣點的個數。本實驗采用樣品2-1作為參比制劑。

當50≤f2≤100 時，表明兩種制劑的溶出曲線相似。相似因子f2計算結果見表4。

表4 f2因子結果統計

由表4可知，秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液以及pH值6.8磷酸鹽緩沖液中f2相似因子均在50～100內，說明不同廠家秋水仙堿片體外溶出行為一致。

3 討論

3.1溶出度與相似因子 在我國藥品市場上仿制藥占比很大，但仿制藥質量參差不齊，嚴重影響了藥品安全和有效性評價。我國于2012年開始進行仿制藥質量一致性評價工程。考察制劑在多種溶出介質下的溶出狀況，可以全面反映制劑的內在質量[13]。近年來研究認為，基于生物藥劑學分類系統(biopharmaceutics classification system，BCS)理論的溶出實驗是最能替代藥物生物等效性研究的體外實驗方法。溶出曲線相似性比較的方法有很多，常見的有兩條溶出曲線相似性參數法、模型依賴法，以及非模型依賴法等。模型依賴法參數物理意義不能解釋清楚。而兩條溶出曲線相似性參數法借鑒了相似等效限法中的逐點比較的做法，在計算中考慮到溶出值的差與溶出的離散度，并在結果判斷中引入基本相似與整體相似的概念，計算簡便。但是兩條溶出曲線相似性參數法為點與點的比較，未考慮溶出值與時間的交互作用。筆者在本實驗中采用非模型依賴法中f2相似因子法評價溶出曲線的相似性，該方法為國家食品藥品監督管理總局(CFDA)推薦使用的方法，也是目前CFDA 推行的口服固體制劑質量一致性評價中使用最廣泛的方法[14-16]，該法簡單迅速，可準確評價受試制劑和參比制劑的溶出行為差異。

筆者在本實驗中選擇了溶出行為較為穩定、溶出均一性良好的樣品2-1作為參比制劑，且采用f2相似因子法評價5個不同廠家不同批次秋水仙堿片的溶出曲線相似性，這在一定程度上可以反映5個廠家片劑內在質量差異。若f2值≥50，則認為兩條溶出曲線溶出行為相似。該方法簡單，可用于快速評價受試制劑與參比制劑溶出行為的相似性。

3.2溶出介質的選擇 固體制劑口服給藥后，藥物的吸收取決于藥物從制劑中的溶出或釋放、藥物在生理條件下的溶解以及在胃腸道的滲透。此外，溶出度實驗應盡可能在生理條件下進行。根據《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》及相關文獻[13]，需要考察參比制劑和仿制制劑在多種介質中溶出曲線的一致性。由于秋水仙堿是一種生物堿，在前期多次預實驗中發現，秋水仙堿片在pH值1.2鹽酸溶液的溶出實驗中不穩定，所以筆者在本實驗中主要考察了秋水仙堿片在水、pH值4.5醋酸鹽緩沖液以及pH值6.8磷酸鹽緩沖液中的溶出狀況。