平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1水平的影響?

高風麗 李竹英

（黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

支氣管哮喘（簡稱哮喘）是以氣道慢性炎癥，氣道高反應性和氣道重塑為主要特征，因其不斷增長的發病率和死亡率而備受世界關注。中國肺健康研究顯示，目前我國哮喘患病人數約4 570萬，總體發病率達4.2%［1］。平喘顆粒是劉建秋教授傳承前輩思想并結合多年臨床實踐經驗所創立，劉教授認為哮喘慢性持續期的病機根本為陽虛痰盛，故平喘顆粒組方的核心思想為溫陽益氣、化痰平喘。前期研究發現［2-4］，平喘顆粒可以通過干預氣道上皮細胞自噬與凋亡，調節樹突細胞免疫功能，降低嗜酸性粒細胞活性和功能等途徑發揮治療哮喘的作用，但其對哮喘氣道重塑的具體機制尚不明確。基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）和基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1（TIMP-1）能夠通過影響細胞外基質的沉積和降解以及平滑肌細胞的功能和遷移來引發氣道重塑［5-6］。本實驗通過觀察平喘顆粒對哮喘小鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1水平的影響，探討平喘顆粒在改善氣道重塑方面的作用機制，為臨床應用平喘顆粒治療哮喘提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取8周齡健康清潔級雌性BALB/c小鼠30只，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2015-0001，體質量（20±2）g，飼養環境溫度（22±1）℃，濕度為45%～55%，自由進食飲水，適應性喂養1周后開始實驗。

1.2 試藥與儀器 平喘顆粒，組方：淫羊藿200 g，太子參150 g，黃芪 150 g，五味子150 g，知母100 g，炙麻黃100 g，款冬花（炙）150 g，地龍100 g，罌粟殼40 g。藥材加水煎煮2次，每2小時過濾1次，通過醇沉方式［7］濃縮成稠膏，相對密度為1.20～1.25（60 ℃），加入蔗糖、糊精適量制成1 000 g顆粒，由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院制備，批號：20180723。普米克令舒（吸入用布地奈德混懸液），2 mL/支，阿斯利康公司，批號：H20140475。卵蛋白（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，A107820）；MMP-9 ELISA試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，20381）；TIMP-1 ELISA試劑盒（廈門侖昌碩生物科技有限公司，20382）。超聲霧化機NB-150U，歐姆龍自動化（中國）有限公司；石蠟切片機RM2235，德國Leica；Lx81研究級倒置熒光顯微鏡，日本Olymps公司；酶標儀ELX-800，美國伯騰儀器有限公司；微量移液器Proline，芬蘭百得實驗室儀器（中國）有限公司；電熱恒溫培養箱DH36001B，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3 分組與造模 40只BALB/c小鼠隨機分為4組，每組10只，分別是對照組、哮喘組、平喘顆粒組、普米克令舒組。對照組腹腔注射及霧化吸入等體積生理鹽水代替OVA激發，其余3組進行慢性哮喘造模。根據文獻［8］方法，應用OVA致敏液［100 μg OVA+1 mg Al（OH）3］激發BALB/c小鼠，制備慢性哮喘小鼠模型。于實驗第1、14日給予小鼠腹腔注射0.2 mL致敏液，22 d后進行霧化激發，霧化吸入1%OVA溶液，每次30 min，每周進行3次，連續激發8周。

1.4 給藥方法 從第1次霧化激發的當天開始，平喘顆粒組按前期研究的最佳質量濃度（1.08 g/mL）含藥溶液灌胃，根據人體與動物的每千克體質量劑量折算系數計算，按照0.1 mL/10 g灌胃，持續給藥8周，激發階段則每次激發前1 h灌。對照組和哮喘組給予等體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃，灌胃時間同平喘顆粒組。普米克令舒組給予普米克令舒藥液0.5 mg/mL（布地奈德1 mg與0.9%氯化鈉注射液2 mL混合），每次霧化30 min，霧化時間同平喘顆粒組。

1.5 標本采集與檢測 1）各組小鼠末次激發24 h后處死，開胸取固定的肺組織行石蠟包埋、切片，將病理切片行Masson染色，光鏡下觀察肺組織的病理學改變。2）采用計算機圖像分析系統（Image-Pro Plus Ver?sion 6.0）分析病理圖像，測定支氣管基底膜周徑（Pbm）、氣道平滑肌面積（WAm）、支氣管總面積（WAt），并將測得的WAm、WAt用Pbm標準化，以WAm/Pbm、WAt/Pbm數值分別表示氣道平滑肌和支氣管管壁的厚度。3）取約小鼠1/2右肺組織勻漿，用ELISA法測定肺組織中MMP-9和TIMP-1的水平，具體操作方法嚴格按照ELISA試劑盒說明書進行。

1.6 統計學處理 應用SPSS20.0統計軟件。計量數據以（）表示，組間比較用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織Masson染色結果比較 對照組小鼠肺組織及支氣管結構基本上處于正常狀態；哮喘組小鼠氣管壁和氣道平滑肌明顯增厚，管腔狹窄，上皮組織增生、脫落，黏膜腫脹、充血，且氣道周圍可見較多的藍色膠原纖維組織。平喘顆粒組上述病理結構改變明顯減輕，但與正常組仍有差距，氣道周圍可見少量的藍色膠原纖維組織。普米克令舒組上述病理結構改變和膠原沉積均明顯減輕，見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織Masson染色（200倍）

2.2 各組小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比較 見表1。與對照組比較，哮喘組小鼠氣道平滑肌厚度、支氣管管壁厚度明顯增加（P<0.05）。給予平喘顆粒和普米克令舒治療后小鼠氣道平滑肌厚度、支氣管管壁厚度明顯降低（P<0.05），兩組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 各組小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比較（μm2/μm，±s）

表1 各組小鼠WAm/Pbm、WAt/Pbm比較（μm2/μm，±s）

注：與對照組比較，?P<0.05；與哮喘組比較，△P<0.05。下同。

組別對照組哮喘組平喘顆粒組普米克令舒組n 10 10 10 10 WAm/Pbm 13.01±0.60 27.56±0.94*15.36±0.39*△15.50±0.27*△WAt/Pbm 35.59±1.64 70.69±3.01*49.04±1.41*△49.53±1.79*△

2.3 各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達水平比較 見表2。與對照組比較，哮喘組小鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達水平明顯增高（P<0.05）。給予平喘顆粒和普米克令舒治療后小鼠肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達水平明顯降低（P<0.05），兩組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達水平比較（ng/L，±s）

表2 各組小鼠肺組織MMP-9和TIMP-1表達水平比較（ng/L，±s）

組別對照組哮喘組平喘顆粒組普米克令舒組n 10 10 10 10 MMP-9 55.22±2.10 92.77±4.89*62.39±2.53*△60.74±3.32*△TIMP-1 49.11±1.19 83.01±3.54*54.10±1.73*△53.67±2.63*△

3 討論

氣道重塑是哮喘的重要病理特征，是哮喘反復發作和遷延不愈所導致的一系列氣道結構的改變，能夠導致患者出現不可逆的氣流受限以及持續存在的氣道高反性，成為哮喘難以根治的主要原因。氣道重塑的過程極為復雜，主要改變包括氣道上皮細胞黏液化生、細胞外基質合成和沉積增加、平滑肌細胞增殖遷移、上皮下膠原沉積和纖維化等。研究表明，細胞外基質在氣道重塑中起到了重要作用，其在氣道壁過度沉積和降解失衡會導致氣道結構和功能的改變［9］。MMP-9是調節細胞外基質的主要限速酶，與其特異性抑制劑TIMP-1共同維持著細胞外基質的正常生長和機體內環境的穩定。正常生理情況下，MMP-9和TIMP-1在機體中保持平衡狀態，若MMP-9和TIMP-1出現過度分泌及比例失調時，這種平衡狀態將被打破，導致氣道壁的細胞外基質出現異常狀態從而引發氣道重塑［10-11］。MMP-9可以通過降解以Ⅳ型膠原為主的細胞外基質和血管中的膠原成分，誘導氣道平滑肌細胞增殖、分化、遷移至氣道壁和血管外，增加平滑肌肌層厚度和促進新血管形成，引發氣道重塑［12-14］。MMP-9能刺激轉化生長因子β1（TGF-β1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等生長因子的釋放，促進上皮下成纖維細胞的增殖分化而參與氣道重塑［15］。TIMP-1通過與MMP-9發生特異性結合而抑制MMP-9的活性，阻礙細胞外基質的降解，使其在氣道內過度沉積而引起氣道壁增厚，進而導致氣道重塑［16］。

平喘顆粒是黑龍江中醫藥大學自制的中藥制劑，由淫羊藿、太子參、黃芪、五味子、知母、炙麻黃、款冬花、罌粟殼、地龍組成。方中淫羊藿、炙麻黃共為君藥，具有溫補腎陽、宣肺平喘之功；黃芪、太子參、五味子、款冬花、地龍共為臣藥，具有益氣助陽、潤肺生津、止咳平喘之功；罌粟殼斂肺止咳，為方中之佐藥，酸澀收斂，可防君藥辛散耗氣；知母潤肺止咳，引方中諸藥歸經，為方中之使藥。方中補陽之劑配伍補陰之品，使陽得陰助而生化無窮，藥物配伍收斂并用，升降有序，虛實同治，與哮喘陽虛痰盛之病機相合，諸藥合用共奏溫陽益氣、化痰平喘之效。本實驗應用OVA致敏液制備慢性哮喘小鼠模型，哮喘組小鼠肺組織可見氣管壁和氣道平滑肌明顯增厚，管腔狹窄，上皮組織增生、脫落，黏膜腫脹、充血，且氣道周圍可見較多的藍色膠原纖維組織等病理改變，WAm/Pbm、WAt/Pbm均明顯增高，表明哮喘模型制備成功，模型組小鼠存在氣道重塑。研究結果顯示，與哮喘組相比，平喘顆粒組和普米克令舒組小鼠氣道病理結構改變和膠原沉積均明顯減輕，WAm/Pbm、WAt/Pbm明顯下降，且肺組織中MMP-9和TIMP-1的表達水平明顯下降。

綜上所述，平喘顆粒可以減輕哮喘小鼠肺組織病理學改變，改善氣道重塑，其機制可能與抑制MMP-9和TIMP-1的表達有關。本文探討了平喘顆粒治療哮喘氣道重塑的作用機制，但哮喘是一種多因素、多機制引發的復雜病癥，且中藥復方成分多樣化，可以通過多靶點、多途徑、多環節發揮治療疾病的作用，故我們今后仍需要大量的實驗研究去探索更加深入，更加全面的作用機制，為臨床的應用奠定基礎。