METTL23基因在豬卵母細胞、早期胚胎和主要器官中的表達

潘奕彤，申屠璐燕，吳玉婷，王恒，李明縉，黃鏡潼，孫夢娟，郭騰龍，張翔棟，張運海,，曹祖兵,*

(1.安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036；2.地方畜禽遺傳資源保護與生物育種安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230036)

養豬業一直是我國重要的傳統產業，是農業生產的重要組成部分。隨著經濟高速發展，居民的膳食結構逐漸發生變化，豬肉成為我國居民最主要的肉副食品。在國家政策扶持和經濟拉動下，生豬養殖業迅速發展，我國能繁母豬的存欄量已達到世界總量的50%。但目前國內母豬的繁育狀況和國外相比還存在很大的差距，國內母豬的繁殖性能還需要大幅度提升[1]。生產管理方面如飼養管理條件、營養條件和環境條件等，母豬自身因素如母豬窩產仔數少、早期胚胎發育停滯和胚胎死亡等都會影響繁殖性能。目前可以通過加強生產管理來避免母豬繁殖性能下降，但是很難改善母豬自身因素來增強母豬繁殖性能。因此，針對提高豬卵母細胞成熟和早期胚胎發育能力的研究具有重要的意義。在哺乳動物早期胚胎發育過程中需要多種基因表達的調控，而表觀遺傳則在基因表達調控中起關鍵作用[2]。表觀遺傳有多種表現形式，組蛋白甲基化修飾是其中重要的調控機制之一[3-4]。在眾多調控表觀遺傳的因子中，精氨酸甲基轉移酶起著不可缺少的調控作用。精氨酸甲基轉移酶(arginine methyltransferases，PRMTs)是甲基轉移酶(methyltransferases，MTs)家族的一個分支，根據其理化性質不同可分為4種類型，且所有家族成員都具有催化精氨酸甲基活性的能力[5]。精氨酸甲基轉移酶在真核生物中起著非常重要的作用，包括動植物的生長、發育及適應過程[6]。動物實驗研究表明，通過催化多種RNA結合蛋白的精氨酸甲基化，精氨酸甲基轉移酶參與調控細胞多種重要的生命過程，如RNA代謝、細胞增殖以及信號轉導等。METTL23(methyltransferase-like 23)是一種精氨酸甲基轉移酶，能夠催化組蛋白H3R17的不對稱二甲基化(H3R17me2a)。在小鼠實驗中，發現METTL23和H3R17me2a均是父源基因組重編程的關鍵調控因子，H3R17me2a不僅負責組蛋白H3.3的整合，還負責父源基因組中活躍的DNA去甲基化。METTL23通過性腺特異性表達(GSE)蛋白質與Tet3相互作用，參與早期胚胎的表觀遺傳修飾[7-8]。

因此，本研究將利用熒光定量PCR技術測定METTL23基因在卵母細胞、早期胚胎以及心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢的相對表達量，并對相對表達量進行統計分析。本研究為后續研究METTL23基因在卵母細胞、早期胚胎發育以及主要器官的生長發育中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

購自安徽浩翔農牧有限公司30日齡長白豬3頭，采集心、肝、脾、肺、腎、卵巢及睪丸組織樣品。豬卵巢購自安徽省肥東福潤屠宰場，在1 h內送至實驗室后抽取直徑3～6 mm卵泡獲取卵母細胞。

1.2 主要試劑和藥品

組織樣品RNA提取試劑盒(E.Z.N.A.?Total RNA Kit II，OMEGA，美國)，組織樣品反轉錄試劑盒(TranScript?One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix，TRAN，北京)，RNA微量提取試劑盒(RNeasy Mini Kit，Qiagen，德國)，卵母細胞和胚胎使用的反轉錄試劑盒(QuantiTect Reverse Transcription Kit，Qiagen，德國)，熒光定量PCR試劑盒(AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，Vazyme，南京)。

1.3 豬各組織樣品的收集

取出-80 °C保存的組織樣品，在研缽中加入液氮進行研磨，研磨過程中不斷加入液氮，確保液氮沒過組織樣，將組織樣粉末加入到裂解液中。本實驗共提取仔豬的心、肝、脾、肺、腎、睪丸、卵巢等7個組織樣品。

1.4 卵母細胞收集和體外培養

收集直徑3～6 mm卵泡中的卵母細胞，用玻璃吸管反復吹吸脫去卵丘-卵母細胞復合體外的卵丘細胞，即GV期卵母細胞。將收集的GV期細胞用預冷的磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次后放入裂解液中，-80 ℃保存。將卵丘細胞包裹較好的卵丘-卵母細胞復合體(COCs)放入體外成熟液中在38 ℃、5% CO2條件下培養42±2 h。

體外成熟液配制：TCM-199中補充100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素，10 ng·mL-1EGF，0.23 ng·mL-1褪黑素，2.03×10-5ng·mL-1LIF，2×10-5ng·mL-1IGF-1，4×10-5ng·mL-1FGF2，10 IU·mL-1eCG，5 IU·mL-1hCG，100 ng·mL-1L-半胱氨酸，5% FBS，10%豬大卵泡濾液。

1.5 孤雌激活和早期胚胎的收集培養

將培養成熟的卵母細胞用0.1%透明質酸酶消化1～2 min，用移液槍反復吹打脫去卵丘細胞，挑選胞質完整、卵周隙清晰且排出第一極體的卵母細胞，即為MII期細胞，收集MII期卵母細胞樣品。然后用體外操作液(T2，TCM199+2% FBS)將挑選出的卵母細胞漂洗3～5次，將卵母細胞轉移至f2液體中進行孤雌激活(1.56 kv·cm-1，80 ms)1次，將MII期卵母細胞放在配置好的化學輔助激活劑中培養4 h，隨后移至胚胎培養液中進行培養。適時收取1-細胞、2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚和囊胚。

1.6 RNA的提取和反轉錄

將收集到的組織樣品，按照RNA提取試劑盒說明書提取組織樣的RNA，按反轉錄試劑盒說明書將提取的總RNA反轉錄成cDNA。

1.7 卵母細胞和胚胎RNA的提取和反轉錄

將GV期、MII期和各時期胚胎樣品，按照RNeasy Mini Kit RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，然后按照QuantiTect Reverse Transcription Kit反轉錄試劑盒進行反轉錄，反轉錄體系：RNA 12 μL，gDNA Wipeout Buffer 2.0 μL，Reverse-transcription master Mix 1.0 μL，Quantiscript RT Buffer 4.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，總體積為20 μL。根據上述反應體系充分混勻后離心30 s，放入PCR儀中42 °C孵育30 min，95 ℃加熱3 min，4 ℃循環，將提取的總RNA反轉錄成cDNA，反應結束后放置-20 ℃保存。

1.8 引物設計和驗證

通過GenBank數據庫檢索豬METTL23基因，根據CDs序列(NC_010454.4)設計4對引物(表1)，訂購并獲得引物后按說明書進行稀釋，濃度為10 μmol。按照PCR擴增體系：cDNA 1.5 μL，2×Premix Taq 7.5 μL，正向、反向引物各0.5 μL，滅菌水5 μL，總體積15 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性30 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。待反應完成后收集擴增產物并配制3%瓊脂糖，進行瓊脂糖凝膠電泳，使用全自動凝膠成像儀成像，分析PCR擴增產物大小是否符合預期，從而確定最適引物。95 ℃加熱3 min，4 ℃保存，將提取的總RNA反轉錄成cDNA，反應結束后放置-20 ℃保存。

表1 4對引物序列信息

1.9 qRT-PCR檢測

按照qRT-PCR試劑盒說明書對卵母細胞、早期胚胎和組織器官進行熒光定量檢測，qRT-PCR反應體系：cDNA 1.5 μL，2×Premix Taq 7.5 μL，正向、反向引物各0.5 μL，滅菌水5 μL，總體積15 μL。qRT-PCR擴增條件：94 ℃預變性30 min；98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。每個樣品進行3次生物學重復和3次技術重復，且每種cDNA樣品都要有內參基因(EF1α1)作為參考，進而分析目的基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 生物信息學分析

通過NCBI數據庫對豬METTL23進行分析(圖1)，發現其包含5個外顯子，定位于12號染色體上，跨越長度4 874 bp，mRNA全長2 501 bp，CDs全長573 bp，編碼190個氨基酸。

圖1 豬METTL23基因序列結構

從氨基酸水平比較(圖2)METTL23在不同物種之間的進化關系，觀察發現，豬和人的親緣關系較為相近，說明兩者之間的親緣關系比較近。

圖2 METTL23氨基酸序列在不同物種間的進化關系

從核苷酸序列比對(表2)發現,METTL23在豬和人之間的同源性為89.18%、豬和牛之間的同源性為90.03%；比較氨基酸序列發現,豬和人之間的同源性為88.95%、豬和牛之間的同源性為91.19%。從核苷酸序列比對(表3)發現，METTL23在豬和羊之間的同源性為90.38%、豬和馬之間的同源性為90.05%；比較氨基酸序列發現,豬和羊之間的同源性為92.23%、豬和馬之間的同源性為91.58%。從而說明METTL23在豬、人、羊之間的同源性高、保守性好。

表2 豬、人、牛METTL23基因同源性比較

表3 豬、羊、馬METTL23基因同源性比較

2.2 RNA完整性和濃度測試

觀察7種組織RNA瓊脂糖凝膠電泳圖(圖3)，各組織的RNA均出現28 s和18 s兩條條帶，且28 s條帶比18 s條帶亮，說明提取的7種組織RNA完整性較好。觀察比較7種組織的RNA濃度和各組織的D260/D280和D260/D230值的情況(表4)，7種組織的RNA完整性較好，且均未發生降解。綜合RNA的完整性、濃度值、D260/D280和D260/D230值可知本次實驗提取的7種器官的RNA均符合實驗要求，可以進行后續實驗。

圖3 各器官RNA瓊脂糖凝膠電泳結果

表4 豬各組織中的RNA濃度

2.3 引物驗證

結合瓊脂糖凝膠電泳圖(圖4)和熔解曲線(圖5)可以得知：引物METTL23-2的目的片段長度在150 bp左右，且無多余擴增條帶，熔解曲線重合度較高，說明其特異性較好。而從熔解曲線看，引物METTL23-1和引物METTL23-4曲線重合度不好，從瓊脂糖凝膠電泳圖來看引物METTL23-3和METTL23-4有多余擴增的條帶，有二聚體產生，均不適合做引物。因此，選用METTL23-2作為最終引物。

M—DNA分子標記；1—METTL23-1 PCR產物；2—METTL23-2 PCR產物；3—METTL23-3 PCR產物；4—METTL23-4 PCR產物。

圖5 qRT-PCR熔解曲線

2.4 METTL23在仔豬各組織中的表達

METTL23在豬卵母細胞和早期胚胎中均有表達(圖6)。在GV時期的表達量最高，MII期卵母細胞表達量與1-細胞時期相似，但從1-細胞時期開始表達量逐漸下降，一直到8-細胞時期達到最低，桑葚胚時期表達量開始上升并持續到囊胚期。表達量依次是GV期、MII期、1-細胞時期、囊胚期、2-細胞時期、4-細胞時期、囊胚期、8-細胞時期。

不同字母表明不同組織之間相對表達量存在顯著性差異(P≤0.05)。圖7同。

METTL23在7種組織中都有表達(圖7)。肝中的相對表達量最高，其次是腎、睪丸和心臟，脾、肺、卵巢的表達量相對較低(P≤0.05)。

圖7 不同組織METTL23相對表達量分析

3 小結與結論

本研究表明，豬METTL23包含5個外顯子，定位于12號染色體上，跨越長度4 874 bp，mRNA全長2 501 bp，CDs全長573 bp，編碼190個氨基酸。此外，METTL23在物種間保守性較高，其中豬和羊的同源性最高。通過比對豬、羊和人等5個物種的METTL23結構，發現該基因所含外顯子、mRNA、CDs等并不完全一致。但是比對豬和羊這2個物種的CDs和氨基酸序列發現，METTL23的同源性和保守性均最高，這可能是由于豬和羊的進化速度比較一致，生物相似程度較高。

本研究主要通過qRT-PCR技術首次檢測了METTL23在豬卵母細胞、早期胚胎以及主要組織中的相對表達水平。結果發現，MELL23在GV、MII期卵母細胞表達量較高，且GV期卵母細胞表達量顯著高于MII期。研究表明，卵母細胞減數分裂和早期胚胎發育受特定的基因表達程序控制，組蛋白甲基化是重要的表觀遺傳修飾機制之一，參與調控卵母細胞減數分裂以及胚胎發育相關基因的表達[9]。在小鼠卵母細胞中，METTL23能催化H3R17的不對稱二甲基化(H3R17me2)，且注射siRNA敲低METTL23蛋白水平后沒有降低其他精氨酸甲基化殘基的水平，研究表明，這類精氨酸甲基轉移酶常與基因的激活相關[10-11]。METTL23在豬卵母細胞和早期胚胎中的調控機制并不明確，這對深入研究其在GV和MII期的表達水平對卵母細胞中減數分裂和某些組蛋白甲基化的調控提供新的思路。METTL23基因在1-細胞、2-細胞、4-細胞以及8-細胞時期的表達量逐漸降低，到8-細胞時期時表達量降至最低，這可能是因為4-細胞到8-細胞時期合子基因組激活，基因組轉錄處于活躍狀態。在小鼠中的研究表明，精氨酸甲基轉移酶在4-細胞到8-細胞時期被激活[12]。桑椹胚和囊胚時期，METTL23的表達量又逐漸升高，這可能是METTL23從細胞核轉運到細胞質中，在外胚層細胞中表達。在小鼠實驗中，敲除PRMT5會使小鼠胚胎發育停滯在囊胚期，這表明精氨酸甲基轉移酶在小鼠囊胚期具有重要作用。而METTL23在豬囊胚期表達量也較8-細胞時期有所提高，這對研究METTL23在囊胚期對豬多能性干細胞的調控作用研究提供思路[13]。精氨酸甲基轉移酶家族成員敲除的小鼠突變體都出現胚胎發育異常或致死的現象[14-15]，表明該蛋白家族在小鼠早期胚胎發育過程中至關重要。因此，深入研究METTL23基因對豬卵母細胞及早期胚胎發育的調控將是后續研究的重點。

本研究表明，METTL23在豬7種組織中均有表達，且具有顯著性差異，METTL23在肝臟中的表達量最高，其次是腎、睪丸和心臟，最后是脾、肺和卵巢。睪丸作為雄性生殖器官的重要組成部分，在生殖過程中起著精子發生的重要作用。已有研究表明，精氨酸甲基轉移酶在小鼠睪丸中高表達。在精子發育過程中，精氨酸甲基轉移酶首先表達在精母細胞的胞質中，而后表達在細胞核中[16]。本次實驗顯示METTL23在豬睪丸中的表達量較高，這對今后在研究METTL23基因在不同物種精子發生過程中的作用具有重大意義。卵巢作為雌性動物的生殖器官，其健康是保證正常生殖的關鍵。有研究表明，女性發生子宮內膜位移癥后，卵巢中的多種精氨酸甲基轉移酶和CARM1蛋白顯著降低，提示精氨酸甲基轉移酶的失調可能會導致卵巢良性和癌前疾病發生，如細胞增殖減弱、異常細胞克隆和基因組不穩定等變化。而且PRMT1、PRMT2和PRMT4等多種精氨酸甲基轉移酶的過表達會影響NOS和NO的合成，而過低的NO濃度會提高女性多囊卵巢綜合征發生的機率[13]。而本次實驗的結果表明，豬卵巢中的METTL23含量并不高，這可能是維持豬卵巢正常功能的關鍵。這對進一步研究METTL23在豬卵巢生長發育、繁殖性能、健康等方面是如何調控的具有重要參考意義。