基于網絡藥理學探討干姜附子湯抗心肌缺血再灌注損傷的作用機制

謝鋒，段廣靖，王斌，衛培峰，陳琳，李敏（陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046）

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MI/RI）[1]是指缺血缺氧的心肌組織恢復血液供應后，心臟結構的進一步破壞以及心肌細胞能量代謝功能障礙的進一步加重，甚至發生不可逆性損傷，主要包括心肌梗死面積的再擴大和危及生命的心律失常。目前，MI/RI的發病機制尚未完全闡明，一般認為鈣超載、凋亡、氧化損傷、炎癥是MI/RI 發生的重要原因[2-3]。

干姜附子湯記載于《傷寒雜病論?太陽病篇》，由干姜和附子配伍組成，相須使用可增強回陽救逆的功效，主治亡陽欲脫及中虛寒盛證。現代藥理學研究表明，干姜附子湯具有抗休克、強心、增加冠狀動脈血流量等作用[4-5]。史琴等[6]研究顯示，干姜附子湯可降低MI/RI 大鼠心電圖ST 段及心肌缺血面積。血清中乳酸脫氫酶（LDH）、心肌肌鈣蛋白Ⅰ（cTn-I）及肌酸激酶同工酶（CKMB）含量明顯下降，提示干姜附子湯對MI/RI 大鼠有保護作用，但其生物過程及具體機制仍不清楚。網絡藥理學（network pharmacology）是研究中藥復方多成分、多靶點、多通路作用機制的重要手段[7-11]，本研究擬通過網絡藥理學對干姜附子湯治療MI/RI 的作用機制進行預測分析并進行實驗驗證，為其深入研究提供基礎。

1 材料

1.1 儀器及試藥

胎牛血清（美國Kirge 公司，批號：20190907）；ATP 酶試劑盒（碧云天生物科技有限公司，批號：20191205）；細胞凋亡檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20200102）；ELx808 全自動酶標儀（美國BIOTeK 公司）；流式細胞儀（美國Thermo Fisher 公司）；淡附片（附子炮制品）（批號：190301）、干姜（批號：190201）（咸陽市北京同仁堂藥店，經陜西中醫藥大學中藥鑒定教研室張崗教授鑒定為正品）。

1.2 細胞種類及來源

大鼠心肌細胞株H9C2 細胞（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：CX0125）。

2 方法

2.1 干姜附子湯中候選活性化合物與靶點的收集與篩選

以附子、干姜為關鍵詞在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php）中檢索附子、干姜的化學成分。以口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似性（DL）≥0.18為標準[12]，獲取附子、干姜主要活性化合物。考慮到化合物含量、代謝及藥理作用，對附子、干姜有效化合物進行補充。附子的主要成分為生物堿，干姜的主要成分為揮發油，故加入現有研究報道的附子、干姜的主要活性成分中[13-14]。根據OB、DL 篩選完后加入deoxyaconitine、aconitine、hypaconitine、mesaconitin、6-gingerol、8-gingerol、10-gingerol、6-shogaol、zingerone 9 個化學成分。在TCMSP 和CTD（http：//ctdbase.org/）數據庫中收集上述獲得成分的靶點。并使用Uniport（https：//www.uniprot.org/）數據庫標準化靶點名稱。進而利用Cytoscape 3.8.0 繪制“干姜附子湯-活性成分-靶點”網絡。

2.2 MI/RI 靶點的收集

以心肌缺血再灌注損傷為關鍵詞在Disgenet[13]（http：//www.disgenet.org/）數據庫中收集MI/RI 靶點。然后將干姜附子湯和MI/RI 的靶點導入韋恩圖在線工具中獲取干姜附子湯抗MI/RI 的靶點。

2.3 干姜附子湯抗MI /RI 的PPI 網絡構建

將干姜附子湯抗MI/RI 的靶點導入到String（https：//string-db.org/）數據庫，選擇Multiple proteins 功能，以Homo sapiens 為條件，將獲得的結果保存為tsv 文件格式，再將其導入Cytoscape 3.8.0，選擇網絡拓撲分析功能可視化結果。

2.4 GO 富集分析和KEGG 富集分析

在DAVID 數據庫[15]（https：//david.ncifcrf.gov/）中選擇Functional Annotation 功能，導入共同靶點后，以Homo sapiens 為篩選條件獲得GO、KEGG 結果。按P＜0.05 為篩選條件，使用R語言制作氣泡圖。

2.5 藥物制備

干姜附子湯按照方中比例（干姜∶附子＝1∶1）混合，在室溫下用8 倍量體積水浸泡0.5 h，然后煎煮2 次，每次1 h。濾液通過4 層紗布收集，合并濾液并濃縮至制成含生藥0.1 g·mL－1的藥液離心，上清液用0.22 μm 水相微孔濾膜除菌，密封。

2.6 分組及造模

將H9C2細胞分為5組：Control 組、Model 組、干姜附子湯低劑量（0.125 mg·mL－1）、干姜附子湯中劑量（0.25 mg·mL－1）、干姜附子湯高劑量（0.5 mg·mL－1）組，除Control 組外，其余4組均參照文獻造模方法[16]建立MI/RI 模型，其中給藥組預處理24 h 后建立MI/RI 模型。

2.7 CCK8 法檢測 H9C2 細胞存活率

將濃度為1×105個·mL－1的H9C2 大鼠心肌細胞鋪板，待細胞完全貼壁后各給藥組給予100 μL 含藥培養液干預，且含藥培養液設置空白對照孔，每個濃度設置6 個復孔，Model 組給予DMEM 完全培養基。培養24 h 后于每孔加入10 μL 的CCK8，培養箱孵育2 h 后，小心吸凈原液，每孔加入100 μL 的DMSO 溶液，至結晶完全溶解后，酶標儀檢測OD值，以空白對照組的吸光度均值為100%，計算其余各組細胞活性。計算公式為：

2.8 H9C2 細胞凋亡率測定

Annexin V-FITC/IP 雙染法檢測凋亡，將造模后的H9C2 細胞培養液吸出至2 mL 離心管內，PBS 小心沖洗后用不含EDTA 胰酶消化細胞，消化后將上述收集的培養液終止消化后轉移至離心管內，離心棄上清液，后加入500 μL 結合液，5 μL Annexin V-FITC，混勻后加5 μL 碘化丙啶后在流式細胞儀檢測H9C2 細胞凋亡率。

2.9 Na＋-K＋-ATP、Ca2 ＋-Mg2 ＋-ATP 酶活力測定

將按“2.6”項下分組的各組細胞，用PBS作為勻漿介質破碎后離心取上清液，按線粒體Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶 試劑盒操作說明，進行酶促反應、定磷，用分光光度計在660 nm 處測定吸光度值，通過磷標準曲線推算線粒 體Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活力，每組均采用復管測定。

2.10 統計學處理

采用SPSS 18.0 統計學軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以α＝0.05 為檢驗水準。

3 結果

3.1 網絡藥理分析結果

3.1.1 干姜附子湯活性成分及靶點篩選 通過TCMSP 平臺以及化合物補充共收集到干姜附子湯中成分16 個，其中附子7 個，干姜9 個（見表1）。獲得作用靶點171 個，成分靶點網絡圖（見圖1）。圖1中三角形代表成分，圓形代表靶點。其中Degree 值排名靠前的成分為附子中的烏頭堿（Degree：45），干姜中的β-谷甾醇（Degree：38），10-姜酚（Degree：26）。提示這些成分可能是干姜附子湯治療MI/RI 的核心成分。

表1 干姜附子湯活性成分表Tab 1 Active ingredients of dried ginger-aconite decoction

圖1 干姜附子湯-活性成分-靶點網絡圖Fig 1 Dried ginger-aconite decoction-active ingredient-target network

3.1.2 干姜附子湯抗MI/RI 靶點收集 Disgenet中獲得MI/RI 靶點966 個。將干姜附子湯的靶點與MI/RI 靶點導入韋恩圖（見圖2）在線工具中獲取干姜附子湯抗MI/RI 靶點80 個（見表2）。

圖2 干姜附子湯抗MI/RI 靶點Fig 2 Anti-MI/RI targets of dried ginger-aconite decoction

3.1.3 PPI 網絡圖構建 將80 個共同靶點導入String 數據庫進行網絡拓撲分析。網絡圖中包含80 個節點，871 條邊（見圖3）。節點的大小表示度值。Degree 值排名前5 的靶點為AKT1、IL6、TNF、MAPK3、TP53。提示這些靶點可能是干姜附子湯抗MI/RI 的核心靶點。

3.1.4 干姜附子湯抗MI/RI 的GO 富集和KEGG通路分析 GO 功能富集分析得到GO 條目158 個（P＜0.05），包括生物過程條目（BP）118 個，主要涉及凋亡過程的負調控，脂多糖介導的信號通路，線粒體膜電位的調節，DNA 損傷響應的固有凋亡信號通路，缺乏配體的外在凋亡信號通路，線粒體中細胞色素C 的釋放，內質網應激反應的固有凋亡信號通路。細胞組成（CC）條目22 個分子，主要涉及胞質溶膠、細胞外區域、核、膜筏、血液微粒。分子功能（MF）條目18 個涉及相同的蛋白質結合、蛋白質均二聚活性、血紅素結合、蛋白質異二聚活性、過氧化物酶活性。根據P值進行排序，選擇前10 進行繪圖，結果見圖4。

KEGG 通路富集篩選得到102 條信號通路（P＜0.05），主要涉及PI3K-Akt、TNF、HIF-1、甲狀腺激素、細胞凋亡等信號通路。如圖5所示，其中排序越靠前，提示越可能是干姜附子湯抗MI/RI 的機制。

3.1.5 干姜附子湯-靶點-通路網絡構建與分析干姜附子湯對應的靶蛋白和通路對應的靶蛋白進行映射后得到32 個共有靶點，對應12 個有效活性成分和10 條信號通路。用Cytoscape 3.8.0 構建“干姜附子湯”治療MI/RI“活性成分-靶點-通路”的網絡藥理圖見圖6。

3.2 細胞實驗

表2 干姜附子湯抗MI/RI 靶點Tab 2 Anti-MI/RI targets of dried ginger-aconite decoction

3.2.1 細胞存活率檢測結果 如表3所示，與Control 組比較，Model 組細胞存活率顯著下降（P＜0.01）；與Model 組比較，干姜附子湯不同濃度作用于H9C2 細胞存活率顯著增加（P＜0.01），且對H9C2細胞有促增殖作用，在預給藥濃度為0.25 mg·mL－1時，存活率最高。

3.2.2 細胞凋亡檢測結果 如圖7心肌細胞凋亡檢測結果顯示，與Control 組比較，Model 組細胞凋亡顯著增加（P＜0.01）；與Model 組比較，各給藥組細胞凋亡顯著減少（P＜0.01），且當干姜附子湯濃度為0.25 mg·mL－1時，細胞凋亡率最低。

3.2.3 Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性檢測結果 如表4所示，與Control 組比較，Model 組細胞Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活力顯著降低（P＜0.01）；與Model 組比較，各給藥組Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 活力均升高（P＜0.01）。

圖3 干姜附子湯抗MI/RI 共同靶點PPI 網絡圖Fig 3 PPI network of anti-MI/RI common targets of dried ginger-aconite decoction

圖4 預測靶點的GO 富集分析Fig 4 GO enrichment analysis of predicted targets

圖5 預測靶點的KEGG 富集分析Fig 5 KEGG enrichment analysis of predicted targets

表3 干姜附子湯對H9C2 細胞存活率的影響(x±s，n ＝6)Tab 3 Effect of dried ginger-aconite decoction on the survival rate of H9C2 cells (x ±s，n ＝6)

表4 干姜附子湯對H9C2 細胞MI/RI 損傷后Na＋-K＋-ATP、Ca2 ＋-Mg2 ＋-ATP 酶活性的影響(x±s，n ＝6)Tab 4 Effect of dried ginger-aconite decoction on Na＋-K＋-ATPase and Ca2＋-Mg2＋-ATPase after MI/RI injury in H9C2 cells (x± s，n＝6)

4 討論

圖6 干姜附子湯成分-靶點-通路圖Fig 6 Composition-target-pathway diagram of dried ginger-aconite decoction

圖7 干姜附子湯對H9C2 細胞MI/RI 損傷后凋亡的影響Fig 7 Effect of dried ginger-aconite decoction on the apoptosis of H9C2 cells after MI/RI injury

在心血管疾病中，缺血性心臟病是致死致殘的主要原因，通常與急性冠狀動脈阻塞有關。臨床上的常見治療策略是通過溶栓或主要經皮冠狀動脈介入治療對缺血區域進行早期再灌注，盡管對挽救受損的心肌有效，但仍可能導致進一步的損傷，例如心肌震顫、心律不齊和心肌細胞死亡等[17]。因此，為了改善急性心肌梗死的臨床結局，探索MI/RI 安全有效的治療干預措施至關重要。

本研究運用網絡藥理學的方法篩選出干姜附子湯的活性成分16 個，預測出其治療MI/RI 的靶點80 個，網絡圖提示烏頭堿、β-谷甾醇、10-姜 酚、AKT1、IL6、TNF、MAPK3、TP53可 能是干姜附子湯治療MI/RI 的核心有效化合物和靶點。GO 富集分析提示干姜附子湯抗MI/RI 主要與凋亡過程的負調控，缺乏配體的外在凋亡信號通路，線粒體膜電位的調節，DNA 損傷響應的固有凋亡信號通路，脂多糖介導的信號通路有關，這些生物過程大多與細胞凋亡有關。KEGG 富集分析提示干姜附子湯可能通過PI3K-Akt、TNF、HIF-1、甲狀腺激素、細胞凋亡等信號通路治療MI/RI。其中細胞調亡、PI3K-Akt、HIF-1 等信號通路均與心肌細胞凋亡有關[18-19]。研究表明，抑制心肌細胞凋亡是治療MI/RI 的一種策略[20-25]。綜上，結合網絡藥理學的預測和先前的研究，本研究擬從細胞凋亡的角度出發，驗證網絡藥理學預測干姜附子湯治療MI/RI 的機制。

線粒體不僅是細胞內合成ATP 的場所，也是細胞凋亡的控制中心。由于心臟的高能量需求，心肌組織中含有較多的線粒體[26]。線粒體內膜上含有大量的Na＋-K＋-ATP 酶和Ca2＋-Mg2＋-ATP酶，這些酶可以維持細胞膜電位，催化ATP 分解成ADP 并釋放能量[27]。當心肌缺血缺氧時，ATP 產生減少，Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP酶活性降低，線粒體內Ca2＋超載，氧自由基大量生成，線粒體膜膜電位發生改變，最終導致細胞凋亡[28]。徐煒棉等[29]研究表明苦參堿可提高阿霉素損傷的H9C2 心肌細胞Na＋-K＋-ATP酶、Ca2＋-ATP 酶活性并減少H9C2 心肌細胞凋亡。霍禮超等[30]研究表明運動可提高胰島素抵抗大鼠Na＋-K＋-ATP 酶活性，胸腺細胞凋亡減少。曾先燕等[31]研究結果提示橙皮素可提高MI/RI 損傷的H9C2 心肌細胞中Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性，并減少心肌細胞凋亡。本研究發現干姜附子湯可顯著提高MI/RI 損傷的H9C2 心肌細胞中的Na＋-K＋-ATP、Ca2＋-Mg2＋-ATP 酶活性并減少H9C2 細胞凋亡率，與文獻結果一致。

綜上，干姜附子湯對心肌細胞MI/RI 損傷具有保護作用，其作用機制可能與改善心肌細胞能量代謝及減少心肌細胞凋亡有關，但其具體作用機制有待進一步研究。