GC-ECD法測定茵梔黃口服液（注射液）中23種有機氯和菊酯類農藥殘留

王娟，李媛，王云霞，謝志民（西安市食品藥品檢驗所，西安 710054）

茵梔黃口服液（注射液）是2019年國家評價性抽檢品種。茵梔黃注射液為原上海和黃藥業有限公司根據中醫名方“茵陳蒿湯”研制而成，茵梔黃口服液為原北京第四制藥廠由茵梔黃注射液改變劑型而來。目前，茵梔黃注射液全國有6 家生產企業擁有10 個批準文號，目前只有神威藥業有限公司少量生產；茵梔黃口服液全國只有北京華潤高科天然藥物有限公司擁有1 個批準文號（國藥準字Z11020607）。處方由茵陳提取物、梔子提取物、黃芩提取物、金銀花提取物組成，具有清熱解毒、利濕退黃的功效。臨床上茵梔黃口服液用于治療新生兒黃疸[1-2]、妊娠期肝內膽汁淤積癥[3]、肝硬化黃疸[4]、青少年膽心綜合征[5]等。茵梔黃注射液屢次報告不良反應和事件[6-7]，國家藥品監管總局在2016年8月23日發布了“總局關于修訂茵梔黃注射液說明書的公告（2016年第140 號）”，公告附件中說明書【禁忌】項包括“2.新生兒、嬰幼兒禁用；3.孕婦禁用”。

近年來，農藥在中藥材種植中廣泛使用，中成藥的農藥殘留問題已引起關注，本品口服液經常用于新生兒黃疸的治療，監測農藥殘留量尤為重要。有機氯農藥如使用最早、應用最廣的殺蟲劑二二三（DDT）和六六六（BHC），BHC 雖已禁用多年，但不易降解，土壤中殘留明顯[8]，DDT 仍在使用，菊酯類農藥則廣泛使用。金銀花在種植過程中病蟲害頻繁且嚴重，農藥防治是主要手段，農藥殘留污染比較嚴重，檢出率較高[9-11]，有機氯和菊酯類農藥均有檢出。梔子中有檢出有機氯[12]，黃芩中有檢出BHC 和DDT[13]，茵陳尚未見報道，原藥材中可能有農藥殘留，所以有必要監測制劑的農藥殘留量。筆者用GC-ECD 法測定茵梔黃口服液（注射液）中23 種有機氯和擬除蟲菊酯類農藥殘留，以期為茵梔黃口服液（注射液）安全性評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 7890A 型氣相色譜儀、63NI-ECD 電子捕獲檢測器、HP-5 毛細管柱：（5%苯基）甲基聚硅氧烷柱（柱長30 m，內徑0.32 mm，膜厚度0.25 μm）（美國安捷倫公司）；RE 52-99 型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

17 種有機氯農藥混合對照品溶液（批號：610005-201802，中國食品藥品檢定研究院，含六氯苯2.03 mg·L－1、α-六六六 1.98 mg·L－1、五氯硝基苯2.02 mg·L－1、γ-六六六 2.08 mg·L－1、七 氯1.97 mg·L－1、艾氏劑1.93 mg·L－1、β-六六六 1.49 mg·L－1、氧化氯丹2.09 mg·L－1、δ-六六六 1.99 mg·L－1、順式環氧七氯2.06 mg·L－1、反式環氧七氯1.95 mg·L－1、反式氯丹2.01 mg·L－1、順式氯丹2.04 mg·L－1、p，p'-滴滴伊2.04 mg·L－1、o，p'-滴滴涕2.06 mg·L－1、p，p'-滴滴滴2.05 mg·L－1、p，p'-滴滴涕20.8 mg·L－1）；對照品溶液百菌清[批號：GBW（E）081500-M351]、三唑酮[批號：GBW（E）081507-5252]、聯苯菊酯[批號：GBW（E）081474-53Μ1]、氯氰菊酯[批號：GBW（E）0811476-2BV2]、氰戊菊酯[批號：GBW（E）081471-J392]、溴氰菊酯[批號：GBW（E）081468-M351]（北京海岸鴻蒙標準物質技術有限公司，濃度均為100 mg·L－1）；氯氟氰菊酯對照品（批號：SB05-42292018，農業部環境保護科研檢測所，濃度為100 mg·L－1）。

正己烷、丙酮均為農殘級；氯化鈉、無水硫酸鈉均為分析純。

1.3 樣品

樣品均為國家評價性抽檢樣品，38 批次樣品來自于16 個省級行政區域，來自于藥品經營單位的有25 批次，來自于藥品使用單位的有13 批次，其中注射液6批（神威藥業集團有限公司）、口服液32批（北京華潤高科天然藥物有限公司）（批號分別為272388、272508、272538、272588、272608、272668、272678、272728、272738、272748、272788、272848、272858、272898、2721247、2721277、2721437、181001、181102、181107、181108、181110、181112、181113、181116、181209、181216、181217，其中口服液中有4 批批號重復）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備

分別精密量取百菌清對照品溶液、三唑酮對照品溶液、聯苯菊酯對照品溶液、氯氟氰菊酯對照品溶液、氯氰菊酯對照品溶液、氰戊菊酯對照品溶液、溴氰菊酯對照品溶液各0.2 mL，置同一50 mL 量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為菊酯對照品儲備液。精密量取17 種有機氯農藥混合對照品液2 mL，置25 mL 量瓶中，精密加入上述菊酯對照品儲備溶液2 mL，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液；精密量取3 mL，置5 mL 量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取茵梔黃口服液5 mL（注射液10 mL），加入丙酮-水（7∶3）的混合溶液15 mL（注射液30 mL），加入5%氯化鈉溶液10 mL（注射液20 mL），振搖 1 min，置分液漏斗中，用正己烷振搖提取3 次，每次10 mL （注射液20 mL），合并提取液，置裝有10 g 無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，振搖，放置30 min。濾過，用少量正己烷洗滌殘渣及濾紙，與上述濾液合并，于40℃減壓濃縮至近干，用正己烷2 mL 分3 次溶解并轉移至佛羅里硅土固相萃取小柱[（博納艾杰爾），用正己烷-丙酮（9∶1）混合溶液10 mL 和正己烷10 mL 預洗]上，用正己烷-丙酮（9∶1）混合溶液10 mL 洗脫，收集上樣液和洗脫液，40℃減壓濃縮至干，加少量正己烷反復3 次操作至丙酮除盡，加正己烷使溶解，定量轉移至5 mL 量瓶中，搖勻，用0.45 μm 的微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.3 色譜條件

采用（5%苯基）甲基聚硅氧烷毛細管柱，63NIECD 電子捕獲檢測器，進樣口溫度250℃，檢測器溫度330℃，不分流進樣。程序升溫：初始60℃，保持1 min；以90℃·min－1速率升至150℃，保持5 min；以1℃·min－1速率升至160℃，保持10 min；以2℃·min－1速率升至220℃；以10℃·min－1速率升至280℃，保持6 min；以10℃·min－1速率升至290℃，保持10 min。載氣高純氮，99.999%，流速60 mL·min－1，進樣量1 μL。

2.4 系統適用性試驗

取陰性茵梔黃口服液（批號：181206，經檢測未含有機氯和農藥殘留的樣品），按照“2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。精密量取“2.1”項下混合對照品溶液 2 mL，置具塞錐形瓶中，氮氣吹干，精密加入茵梔黃口服液 （批號：181206）5 mL。按照“2.2”項下方法制備加標供試品溶液。分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液及上述陰性樣品溶液及加標供試品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，按“2.3”項下色譜條件進樣。在該色譜條件下，各色譜峰分離良好，峰形對稱，陰性樣品對測定無干擾，結果見圖1。

圖1 茵梔黃口服液（注射液）氣相色譜圖Fig 1 Gas chromatogram of Yinzhihuang oral liquid （injection）

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密量取17 種有機氯農藥混合對照品溶液2 mL，置5 mL 量瓶中，精密加入“2.1”項下菊酯對照品儲備溶液2 mL，加正己烷稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品儲備液，逐級稀釋制成不同濃度的系列混合對照品溶液。分別精密吸取系列混合對照品溶液各1 μL，注入氣相色譜儀，以對照品溶液（μg·L－1）為橫坐標、峰面積為縱坐標，計算得回歸方程，相關系數均＞0.999。說明在該系統條件下，各組分在對應濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系，結果見表1。

2.5.2 儀器精密度考察 精密吸取“2.5.1”項下高、中、低質量濃度對照品溶液各1 μL，每份進樣6 次，計算變異系數。結果除o，p'-滴滴涕RSD為2.1%、氯氰菊酯RSD為2.5%外，其余21種農藥的RSD均小于2.0%。

2.5.3 重復性試驗 精密量取“2.1”項下混合對照品儲備液3 mL 共6 份，置具塞錐形瓶中，氮氣吹干，精密加入茵梔黃口服液（批號：181206）5 mL，按“2.2”項下方法制備樣品溶液，取“2.1”項下對照品溶液和樣品溶液各1 μL，按“2.3”項下色譜條件測定（n＝3）。按外標一點法計算含量RSD，結果均小于1.2%。

2.5.4 穩定性試驗 分別于0、2、4、8、12、16、20 和24 h 精密吸取重復性考察項同一供試品溶液1 μL，按“2.3”項下色譜條件測定，計算變異系數，結果23 種農藥峰面積的RSD均小于5%，表明供試品溶液中23 種農藥在24 h 內均穩定。

2.5.5 加樣回收試驗 取“2.5.3”項下供試品溶液6份，分別加入含百菌清、三唑酮和5 種菊酯濃度32 μg·L－1、其余17 種有機氯濃度160 μg·L－1的混合對照品溶液3 mL，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率。結果23 種農藥的回收率為81.68%～116.2%（見表2）。

2.5.6 檢測限和定量限

① 加樣對照品溶液的制備：精密量取各對照品溶液制成含百菌清、三唑酮、5 種菊酯質量濃度為6 μg·L－1，17 種有機氯質量濃度為20 μg·L－1的溶液作為1 號混合對照品溶液；稀釋制成百菌清、三唑酮、5 種菊酯質量濃度1.8 μg·L－1、17 種有機氯質量濃度6 μg·L－1的溶液作為2 號混合對照品溶液。

② 檢測限和定量限的測定：精密量取上述1號混合對照品溶液0.7 mL、1.3 mL，2 號混合對照品溶液0.7 mL、1.3 mL，置具塞錐形瓶中，氮氣吹干，分別精密加入茵梔黃口服液（批號：181110）樣品5 mL，共4 份，按照“2.2”項下樣品制備方法，制備供試品溶液。按“2.3”項下條件測定，以基線噪音3 倍量峰高時的含量為檢測限、10 倍量峰高時的含量為定量限，結果見表2。

表1 有機氯和擬除蟲菊酯類的回歸方程Tab 1 Regression equation of organochlorine and pyrethroid pesticides

表2 有機氯和擬除蟲菊酯類的添加回收試驗、檢測限及定量限Tab 2 Recovery，limit of detection and limit of quantitative of organochlorine and pyrethroid pesticides

2.6 樣品的含量測定

對28 批口服液、6 批注射液進行測定，均未檢出農藥殘留。結果均符合按新生兒（體質量5 kg）一日最大服用量計算的限度。

3 討論

3.1 11 號色譜峰的說明

色譜圖中11 號峰為環氧七氯，是順式環氧七氯和反式環氧七氯的混合物。

3.2 樣品提取、凈化方法的選擇

筆者比較了濃硫酸凈化和固相萃取柱（Florisil）凈化兩種方法，結果菊酯類農藥在濃硫酸凈化中幾乎零回收，故選用固相萃取柱凈化法[14-16]。茵梔黃口服液制法中每1000 mL 含有蔗糖100 g、蜂蜜50 g[17]，屬于高糖樣品，在提取過程中應去除糖類物質的干擾。丙酮水溶液的鹽析作用可除去糖類等水溶性的雜質，用于含多糖類樣品中農藥的提取。