高效液相色譜波長切換法同時測定葆腎合劑中6種成分的含量

馮子芳，費逸明，袁曉航，陳曉偉，胡敏敏，費倩倩（南京中醫藥大學附屬無錫市中醫醫院藥學部，江蘇無錫 214000）

葆腎合劑是在臨床經驗的基礎上研發出的院內自制制劑，處方由芡實、黃芪、米仁根、金櫻子、覆盆子、僵蠶、石韋7 味中藥組成，具有健脾益腎、清熱利濕的功效。作為“益腎固絡”法，是治療早中期慢性腎臟病的基本方，廣泛應用于臨床，療效顯著。鑒于其良好的臨床療效和應用前景，應制訂制劑的質量標準，為制劑的進一步開發提供必要的技術研究基礎資料。

目前，已有對于葆腎合劑提取工藝及臨床療效的研究[1-2]，質量標準中對方中的黃芪、金櫻子和覆盆子進行了定性鑒別，但并未進行定量控制。中藥復方的療效是多組分協同作用的結果[3-4]，為了更全面地控制葆腎合劑的質量，保證臨床療效，本研究建立了高效液相色譜波長切換法同時測定葆腎合劑中黃芪（毛蕊異黃酮葡萄糖苷）、米仁根（薏苡素）、金櫻子、覆盆子（鞣花酸）及石韋（綠原酸、咖啡酸、芒果苷）5 味藥材多指標成分的定量方法[5-9]，以期為制劑的開發和質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent公司），DAD 二極管陣列檢測器（美國Agilent 公司）；BSA224S-CW 電子天平（德國Sartorius 公司）；DGG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；KQ-100 型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

薏苡素（批號：J24M10L89214）、咖啡酸（批號：W16010B100366）、芒果苷（批號：P04M9F60454）（純度均≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號：111920-201606，供含量測定用，純度：97.6%）、鞣花酸（批號：111959-201602，純度：98.3%）、綠原酸（批號：110753-201817，純度：96.8%）（中國食品藥品檢定研究院）；乙腈、磷酸（色譜純，美國Fisher 公司）；水為超純水，其余試劑均為分析純。

供試驗用的葆腎合劑由制劑室根據處方將7 味藥材提取、濃縮、滅菌、灌裝制得，共制成3 個批次，批號分別為：191201、191202、191203。

1.3 藥材飲片

藥材購自不同批號、不同廠家和不同產地，經無錫市中醫醫院副主任中藥師胡敏敏鑒定符合藥典規定。芡實（批號：190215，江蘇蘇軒堂，產地：廣東）；黃芪（批號：191126，南京海源，產地：甘肅）；米仁根（批號：190801，東方慧醫華康，產地：貴州）；金櫻子（批號：190415，江蘇蘇軒堂，產地：江西）；覆盆子（批號：190401，蘇州春暉堂，產地：浙江）；炒僵蠶（批號：190901，東方慧醫華康，產地：江蘇）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件[10]

色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動相：乙腈（A）-0.2%磷酸水（B），檢測波長分別為326 nm（0 ～26 min：檢測綠原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素）和254 nm（26 ～75 min：檢測鞣花酸、毛蕊異黃酮葡萄糖苷）；梯度洗脫（0 ～10 min，92%B；10 ～12 min，92%→89%B；12 ～50 min，89%B；50 ～65 min，89%→80%B；65 ～75 min，80%→92%B）； 流速1.0 mL·min－1；進樣體積10 μL。

2.2 混合對照品溶液[11]

精密稱取綠原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品適量，加甲醇溶解，配制成每1 mL 含綠原酸1.92 mg、咖啡酸1.01 mg、芒果苷4.7 mg、薏苡素1.38 mg、鞣花酸1.06 mg 和毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.96 mg 的混合對照品溶液，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3 供試品溶液

按葆腎合劑處方組成，稱取不同批號和產地的藥材，加10 倍量水，浸泡30 min，煎煮3 次，每次煎煮2 h。分裝制成每瓶200 mL，即得，共制成3 個批次。精密量取3 批葆腎合劑樣品各1.5 mL，置5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，超聲（100 W，40 kHz）10 min，放冷后甲醇定容至刻度，搖勻，用0.22 μm 微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液

按“2.3”項下方法分別制備缺黃芪、米仁根、石韋、覆盆子和金櫻子的陰性樣品溶液，備用。

2.5 專屬性考察[12-13]

取混合對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣10 μL，結果基線穩定，峰形對稱，分離度較好，峰信息量大，各峰保留時間適中，能夠滿足含量測定的需要，見圖1。

2.6 線性關系考察

圖1 葆腎合劑的高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of Baoshen mixture

精密移取“2.2”項下混合對照品溶液適量，加甲醇溶解，稀釋制成不同濃度的系列溶液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄峰面積。以各對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得線性回歸方程：綠原酸為Y＝12.22X－15.13，r＝0.9999，線性范圍為3.26 ～74.34 μg·mL－1；咖啡酸為Y＝33.86X－16.759，r＝0.9999，線性范圍為1.72 ～39.20 μg·mL－1；芒果苷為Y＝7.444X－4.038，r＝0.9998，線性范圍為1.61 ～36.85 μg·mL－1；薏苡素為Y＝15.78X－4.972，r＝0.9999，線性范圍為2.17 ～36.34μg·mL－1；鞣花酸為Y＝98.30X－61.00，r＝0.9999，線性范圍為1.65 ～37.65 μg·mL－1；毛蕊異黃酮葡萄糖苷為Y＝23.79X－25.58，r＝0.9999，線性范圍為3.28 ～74.96 μg·mL－1。

2.7 精密度試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件，連續進樣6 次，記錄綠原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，結果峰面積RSD分別為0.44%、0.36%、0.28%、0.54%、0.21%和0.39%，表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

取批號為191202 的葆腎合劑，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄綠原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的峰面積，結果峰面積RSD分別為1.8%、2.0%、1.5%、2.2%、2.1%和1.4%，表明該方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗

取“2.3”項下供試品溶液（批號：191202），按“2.1”項下色譜條件，分別在0、1、2、4、8、16 h 測定，結果綠原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰面積的RSD分別為2.1%、1.1%、2.2%、0.96%、1.7%和1.5%，表明供試品溶液在16 h 內穩定。

2.10 加樣回收試驗

精密量取葆腎合劑提取液0.75 mL，按1∶1 精密加入混合對照品溶液0.5 mL，按“2.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，進樣測定，記錄峰面積。結果綠原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的平均加樣回收率分別為96.7%、98.0%、97.9%、99.9%、97.1%和98.2%，RSD分別為1.8%、1.8%、2.2%、2.8%、2.2%和2.5%。

2.11 樣品測定

取3 批葆腎合劑樣品，按“2.3”項下方法平行制備3 份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，結果見表1。

3 討論

3.1 指標成分的選擇

中藥制劑具有多成分、多靶點作用的特點，目前國內外正逐漸采用多指標、多手段等中藥質量評價模式，最終達到控制其整體質量的目的[14-15]。本方以芡實為君藥，益腎固攝、健脾除濕；臣藥以黃芪益氣固攝，米仁根清利濕熱；佐藥以金櫻子、覆盆子助芡實益腎固攝；以石韋助米仁根清利濕熱；以僵蠶為使，增搜剔通絡之力，使諸藥達于病所，發揮更好的療效。方中芡實為君藥，以碳水化合物為主（82.6%），另有少量蛋白質（6.78%）、脂肪（0.71%）和微量元素等[16]，但其中醫功效物質基礎始終未能明確[17]。臣藥黃芪所含主要成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷、米仁根主要成分薏苡素，佐藥金櫻子、覆盆子代表性成分鞣花酸，石韋主要成分綠原酸、咖啡酸和芒果苷，故選擇這幾個成分作為指標進行定量控制。

表1 葆腎合劑中6 種成分的含量測定結果(n ＝3，mg·g－1)Tab 1 Content determination of 6 components in Baoshen mixture (n ＝3，mg·g－1)

3.2 色譜柱的選擇

采用不同色譜柱[Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），YMC-Pack ODS-A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）]，考察其對特征峰分離度的影響，最終選擇Waters XBridge C18色譜柱，可以達到有效成分分離測定的要求，且準確可靠、重復性好。

3.3 流動相的選擇

通過對比不同流動相系統對分離效果的影響，選擇乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液等流動相進行考察，結果表明乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相梯度洗脫時，基線平穩，各峰分離度良好。

3.4 檢測波長的確定

在建立液相方法時，采用DAD 檢測器進行全波長（200 ～400 nm）掃描[18-19]，發現由于制劑中有效成分性質差異較大，不同成分最大吸收波長不一致，為減小波長對含量測定結果的影響，最終確定采用波長切換法，在326 nm 處測定綠原酸、咖啡酸、芒果苷和薏苡素，在254 nm處測定鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷。

3.5 小結

本試驗建立了 HPLC 波長切換法同時測定葆腎合劑中綠原酸、咖啡酸、芒果苷、薏苡素、鞣花酸和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，該方法簡便可靠、準確度高、重復性好，為葆腎合劑質量評價和控制提供了依據。