高效液相色譜法測定度魯特韋的手性雜質

孫寶丹，周靈祺，柳宏巧，王忠美，李翔，王世輝*（.寧波諾柏醫藥有限公司，浙江 寧波 35000；.浙江朗華制藥有限公司，浙江 臺州 37000）

度魯特韋是一種人類免疫缺陷病毒類型1 整合酶鏈轉移抑制藥，臨床上適合與其他抗逆轉錄病毒藥聯用，治療成年、12 歲以上和體質量超過40 kg 兒童的HIV-1 感染[1-3]。藥理學研究表明度魯特韋（4R，12S）構型的抗病毒作用強于其他3個手性構型（化學結構式見圖1）[4-6]，因此在度魯特韋質量控制方面，有效控制其他3 個手性雜質非常有必要，但國內目前尚未見關于手性檢測這方面的報道。本研究建立了度魯特韋手性雜質的高效液相色譜檢測方法，可作為度魯特韋原料藥和制劑手性純度的評價方法。

圖1 度魯特韋及手性雜質A、B、C 的化學結構Fig 1 Structure of dolutegravir and chiral impurities A，B and C

1 儀器與試藥

高效液相色譜HPLC（安捷倫1200，配備DAD 檢測器，Chemstation 數據處理系統）；XS205分析天平（十萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司），度魯特韋供試品（原料藥批號：1910001、1910002、1910003； 片劑批號：W66M；Glaxo Opearations UK Ltd），度魯特韋（批號：RS-1909001，含量：99.9%）、手性雜質A（批號：RSCIMPA-1909001，含量：99.2%）、手性雜質B（批號：RS-CIMPB-1909001，含量：92.0%）、手性雜質C（批號：RS-CIMPC-1909001，含量：91.2%）對照品（浙江朗華制藥有限公司）；乙腈、甲醇（色譜純，Honeywell）；超純水；磷酸色譜級（阿拉丁）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：DAICEL OJ-RH（150 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流速：0.4 mL·min－1；柱溫：40℃；檢測波長：254 nm；進樣量：10 μL；以0.2%磷酸水溶液為流動相A，甲醇為流動相B，乙腈為流動相C，梯度洗脫程序見表1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 溶劑 流動相A∶流動相B ＝1∶1（V/V）。

2.2.2 供試品溶液 稱取度魯特韋供試品25 mg置于50 mL 量瓶中，用溶劑超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

表1 梯度洗脫程序表(%)Tab 1 Gradient elution programme (%)

2.2.3 0.20%對照溶液 稱取度魯特韋對照品25 mg，置于50 mL 量瓶中，用溶劑超聲溶解并定容至刻度，搖勻，作為對照品溶液；精密移取對照品溶液0.2 mL，置于100 mL 量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為0.20%對照溶液。

2.2.4 混合手性雜質對照品溶液 稱取對照品度魯特韋25 mg、手性雜質A 25 mg、手性雜質B 25 mg 和手性雜質C 21 mg 置于100 mL 量瓶中，用溶劑溶解并稀釋至刻度，移取上述溶液5 mL 置于25 mL 量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合手性雜質對照品儲備液。移取上述混合手性雜質對照品儲備液1.5 mL 置于100 mL 量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合手性雜質對照品溶液。

2.2.5 混合對照品溶液 稱取度魯特韋對照品25.0 mg，置于50 mL 量瓶中，用“2.2.4”項下混合手性雜質對照品溶液溶解至刻度，搖勻，作為系統適用性溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 分別量取“2.2”項下的溶劑、供試品溶液、混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，結果度魯特韋保留時間約為18 min，理論板數按度魯特韋峰計為6370，與相鄰手性雜質峰分離度為2.5，拖尾因子1.17，符合要求（見圖2）。

圖2 度魯特韋手性檢測系統適用性圖譜Fig 2 Chromatograms of system suitability test for dolutegracir

2.3.2 定量限和檢測限 取“2.2.4”項下混合手性雜質對照品溶液進行逐級稀釋，按“2.1”項下色譜條件進樣分析。當信噪比（S/N）為3∶1 時，測得度魯特韋和手性雜質A、B、C 的檢測限分別為25、25、27、30 ng·mL－1；當信噪比（S/N）為10∶1 時，測得度魯特韋和手性雜質A、B、C 的定量限分別為83、83、89、100 ng·mL－1。

2.3.3 儀器精密度 取“2.2”項下系統適用性溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣測定6 次，記錄峰面積。結果度魯特韋及手性雜質A、B 和C 的RSD分別為0.00%、0.20%、0.89%和1.1%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性 按照“2.2.5”項下混合對照品溶液配制方法，平行配制6 份溶液，由同一分析人員進樣分析，測定其手性純度。結果度魯特韋峰和手性雜質A、B、C 的RSD分別為0.00%、1.9%、2.7%和1.6%，結果表明方法重復性良好。

2.3.5 中間精密度 在不同時間，使用不同儀器，由不同分析人員按照“2.2.5”項下混合對照品溶液的配制方法，平行配制6 份溶液，按“2.1”項下色譜條件測定其手性純度，結果度魯特韋、手性雜質A、B 和C 的RSD結果分別為0.00%、2.6%、5.0%和2.9%（n＝2），結果表明中間精密度良好。

2.3.6 溶液穩定性 取“2.2.2”項下的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件每隔2 h 進樣分析，結果度魯特韋和手性雜質C 在48 h 內RSD分別為0.40%和0.00%；手性雜質A 和B 在48 h 內均未檢出，結果表明供試品溶液在48 h 內是穩定的。

2.3.7 線性關系考察 分別移取“2.2.4”項下混合手性雜質對照品儲備液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 和5.0 mL 置100 mL 量瓶中，加入溶劑稀釋至刻度，配制成線性溶液；分別進樣上述線性溶液，記錄色譜峰面積。以度魯特韋和各手性雜質的峰面積（A）對質量濃度（C）進行線性回歸，按照標準曲線法（雜質斜率除以主成分斜率），計算各雜質與主成分的校正因子，結果見表2，度魯特韋和手性雜質A、B、C 在對應線性范圍內與峰面積線性關系良好。

表2 線性結果表Tab 2 Linearity

2.3.8 準確度 準確稱取1910001 批次度魯特韋供試品共9 份，每個準確度水平配制3 份雜質加樣溶液，進樣測定。各雜質在0.05%、0.15%和0.25%水平進行加樣配制。手性雜質A、B、C 平均加樣回收率均在81.38%～100.7%，RSD均在0.33%～4.2%，準確度良好。

2.3.9 耐用性 取“2.2”項下的系統適用性溶液，分別在流速變化（±0.05 mL·min－1）、色譜柱溫度變化（±5℃）、檢測波長變化（±2 nm）、磷酸濃度變化（±0.05%）等色譜條件下進行測定，測得系統適用性均滿足要求，表明在其他條件不變的情況下，流速、柱溫和波長的微小變化對度魯特韋與手性雜質的分離均無明顯影響，說明該方法耐用性較好。

2.3.10 供試品手性雜質檢測 依法對1 批片劑和3批原料藥供試品進行手性雜質檢測，結果見表3。

表3 度魯特韋批含量檢測結果表Tab 3 Content determination of dolutegravir

3 討論

3.1 波長的選擇

對手性雜質混合溶液儲備液在200 ～400 nm波長范圍內進行紫外最大吸收掃描，發現度魯特韋和其手性雜質的最大吸收波長均為254 nm，因此選擇254 nm 作為檢測波長。

3.2 色譜柱的選擇

考察了IC、AD-3R 和OJ-RH 3 種手性色譜柱對度魯特韋和手性雜質分離的情況。IC 柱：度魯特韋峰拖尾嚴重，與手性雜質無法分離；AD-3R 柱：度魯特韋與雜質A 和B 分離較好，但與雜質C 分離選擇性差，調整洗脫程序，改善不大；OJ-RH 柱：對度魯特韋和手性雜質A、B 和C 都有較好的選擇性，因此最終選擇OJ-RH 作為檢測色譜柱。

3.3 流動相的選擇

度魯特韋和手性雜質A、B 和C 都是鈉鹽，易溶于酸性溶液，因此選擇磷酸水溶液作為水相；考察了乙腈、甲醇、異丙醇作為有機相時度魯特韋和各手性雜質分離的情況，手性選擇性：乙腈＜甲醇≈異丙醇，但是甲醇和異丙醇洗脫能力較弱，尤其是異丙醇，即使占流動相比例高達75%，度魯特韋的出峰時間仍然很晚，峰展寬非常嚴重，因此最終將甲醇和乙腈相結合作為有機相，這樣既滿足分離要求，又能提高洗脫能力。

綜上所述，本文所建立的高效液相色譜法可以準確測定度魯特韋的手性雜質，方法學研究表明該方法準確度高、重復性好、專屬性強，且能為度魯特韋原料藥甚至是制劑的手性雜質標準的建立提供技術支持。