云浮地區肺結核病患者結核分枝桿菌復合群耐藥性分析

林小玲， 梁立鋒， 吳影桃， 趙杰明， 蔡秋月

（1.羅定市人民醫院檢驗科，廣東 云浮 527200；2.云浮市慢性病防治中心檢驗科，廣東 云浮 527300；3.云浮市慢性病防治中心結核病防治科，廣東 云浮 527300）

結核病是由結核分枝桿菌復合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTBC）感染引起的一種嚴重危害人類健康的慢性傳染病，傳染性強。我國是結核病高負擔國家，近年來的流行病學調查結果顯示，我國肺結核病的發病率越來越高，耐藥情況也相當嚴重，已逐漸呈現出高感染率、高發病率、高耐藥率、高死亡率等特點[1-3]，尤其是耐多藥和廣泛耐藥結核病，已經成為結核病防治的挑戰性難題[4]。另外，非結核分枝桿菌（Nontuberculous mycobacterium，NTM）感染也較常見，發病率也呈逐年上升趨勢[5]，患者發病癥狀、影像學檢查及痰涂片鏡檢與肺結核病易混淆，常導致誤診。鑒于各地區結核病疫情特點的不同[6]，為了解云浮地區肺結核病流行狀況及耐藥特點，以便制定有效、合理的治療方案，本研究分析了云浮地區近3年MTBC的耐藥情況。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2016—2019年分離自云浮市區及云安區、新興縣、羅定市和郁南縣5個慢性病防治機構結核病門診確診結核病初診患者痰培養陽性菌株1 571株，患者男1 158例、女413例，年齡14～92歲。MTBC標準菌株H37Rv由廣東省結核病控制中心提供，冷凍保存。

1.2 儀器和試劑

HR40-ⅡA2型生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司），450型CO2培養箱（上海精密實驗設備有限公司），22 SWG標準接種環（廣州市尤德生物科技有限公司）。改良中性羅氏培養基、酸性羅氏培養基、500 μg/mL對硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）培養基以及9種含藥培養基，9種含藥培養基分別為4種一線抗結核病藥物培養基（異煙肼0.2 μg/mL、利福平40 μg/mL、鏈霉素4 μg/mL、乙胺丁醇2 μg/mL）、5種二線抗結核病藥物培養基（氧氟沙星2 μg/mL、卡那霉素30 μg/mL、丙硫異煙胺5 μg/mL、對氨基水楊酸2 μg/mL、卷曲霉素40 μg/mL），購自珠海貝索生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTBC分離、培養 將痰樣本用4%NaOH溶液處理后，分別接種于4支酸性羅氏培養基，培養8周，培養物涂片染色確定為抗酸菌后，納入本研究的病例菌株。

1.3.2 MTBC鑒別試驗 以PNB培養基作為鑒別培養基，將入選菌株同時接種于空白改良中性羅氏培養基（空白對照培養基）和PNB培養基，空白對照培養基生長而PNB培養基不生長，即為MTBC；在空白對照培養基和PNB培養基上都生長，即為NTM。具體操作步驟參照《耐多藥肺結核防治管理工作方案》[7]與《結核病實驗室檢驗規程》[8]進行。

1.3.3 體外藥物敏感性試驗 采用比例法進行菌株對9種抗結核病藥物的體外藥物敏感性試驗，操作按照《結核病實驗室檢驗規程》[8]進行。

1.4 質量控制

本結核病實驗室由廣東省結核病控制中心定期督導質控。MTBC菌群鑒別試驗和體外藥物敏感試驗由經過培訓的技術人員操作，并嚴格按照標準操作程序進行，均以H37Rv標準敏感菌株作為質控敏感對照，在含藥培養基上均不生長。以空白對照培養基生長而PNB培養基不生長為MTBC菌群鑒別試驗質控合格，否則重復試驗，直至合格。空白對照培養基上菌落生長良好，且高稀釋度對照培養基上菌落數≥20個，則體外藥物敏感性試驗質控合格，否則重復試驗，直至合格。

1.5 統計學方法

采用Excel 2003軟件進行數據分析，計數資料用率表示。

2 結果

2.1 MTBC鑒別試驗結果

1 571株分枝桿菌臨床分離株中，有1 514株（96.4%）被鑒定為MTBC，57株（3.6%）被初步鑒定為NTM。

2.2 體外藥物敏感性試驗結果

2.2.1 總體耐藥情況 1 514株MTBC中，有237株（15.70%）存在不同類別的耐藥，其中單耐藥145株（9.60%）、多耐藥57株（3.80%）、耐多藥34株（2.20%）、廣泛耐藥1株（0.07%）。

2.2.2 MTBC對不同藥物的耐藥情況 237株耐藥MTBC對一線抗結核病藥物的耐藥率從高到低依次為鏈霉素（11.2%，170株）、異煙肼（7.5%，114株）、利福平（3.7%，56株）、乙胺丁醇（3.4%，51株）；對二線抗結核病藥物的耐藥率從高到低依次為氧氟沙星（1.8%，27株）、對氨基水楊酸（1.5%，23株）、卷曲霉素和丙硫異煙胺（0.5%，7株）、卡那霉素（0.3%，4株）。

2.2.3 耐多藥和廣泛耐藥菌株交叉耐藥情況 耐多藥菌株對一線抗結核病藥物乙胺丁醇的耐藥率最高（67.6%），對二線抗結核病藥物氧氟沙星的耐藥率最高（23.5%，8株），其次為卷曲霉素、對氨基水楊酸、丙硫異煙胺，均為5.9%（2株），對卡那霉素的耐藥率為0；僅有的1株廣泛耐藥菌株對一線和二線抗結核病藥物均耐藥。

2.2.4 耐多藥和廣泛耐藥菌株耐藥譜 耐多藥菌株藥耐譜中，一線抗結核病藥物以異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇組合最為常見，耐藥率高達41.2%；二線抗結核病藥物以異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇+氧氟沙星組合最常見，耐藥率為14.7%。1株廣泛耐藥菌株對所有藥物均耐藥。見表1。

表1 耐多藥菌株耐藥譜

3 討論

結核病嚴重威脅公眾健康，NTM的傳染性雖不強，但同MTBC一樣嚴重危害公眾健康。NTM感染與MTBC感染在治療上有較大差異，誤治會對患者感染部位造成實質性損傷，極大影響NTM感染患者的預后[9]，所以NTM感染所致肺部疾病的準確診斷非常關鍵。本研究1 571株菌株中，分離出NTM 57株，檢出率為3.6%，遠低于全國平均水平（22.9%）[10]和鄰近市——肇慶的12.34%[11]，與本地區所屬省份——廣東省的1.85%[12]和鄰近市——茂名市的1.71%[13]相近，提示NTM分布存在地區差異。目前，結核分枝桿菌與NTM感染導致的結核病診斷金標準是羅氏培養法，因細菌生長緩慢，通常需4～8周才能出結果，無法滿足臨床需求。

耐藥是結核病化療失敗的主要原因之一。本研究有237株MTBC耐藥菌株，總耐藥率為15.7%，低于全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告顯示的42.1%[10]，也低于廣東省（21.93%）及珠海市和茂名市的總耐藥率（19.74%、18.25%）[12-14]，提示本地區MTBC耐藥水平較低。

體外藥物敏感性試驗結果顯示，本地區MTBC主要以單耐藥為主，耐2種及以上藥物菌株所占比例較小，其中單耐藥、耐多藥、多耐藥菌株的耐藥率分別為9.60%、3.80%、2.20%，較全國的16.50%、31.60%、11.70%低，與廣東省[12]的12.90%、5.82%、2.99%相近。本地區廣泛耐藥率（0.07%）比全國（2.10%）及廣東省（0.34%）低，提示本地區總耐藥和各類型耐藥水平均接近或低于全國和本省水平，但仍需提高初診患者的治療質量，從源頭上減少耐藥的產生。本研究廣泛耐藥病例雖僅有1例，但提示本地區已存在廣泛耐藥結核病患者，應加強監測，防止擴散傳播。

本研究結果顯示，云浮地區的結核病患者對一線抗結核病藥物鏈霉素和異煙肼耐藥最嚴重，與全國及廣東省的情況相符，可能與以前肺結核病治療方案以鏈霉素+異煙肼組合為主有關。因此，臨床在制定化療方案時，對鏈霉素+異煙肼的使用應慎重。本研究中，菌株對二線抗結核病藥物氧氟沙星和對氨基水楊酸的耐藥率最高，異于廣東省（氧氟沙星和卷曲霉素）和茂名市（對氨基水楊酸和卡那霉素），提示不同地區MTBC耐藥情況有所不同，臨床醫生應根據當地菌株的耐藥特點制定合理的治療方案。本地區結核病患者對氟喹諾酮類藥物（氧氟沙星）的耐藥率最高，可能與其本身為廣譜抗菌藥物，基層醫務人員在日常診療過程中過早使用該藥物有關。因此，對于不明原因的感染或肺結核病合并肺部感染的患者，應合理使用喹諾酮類藥物，避免因耐藥影響治療。

耐多藥和廣泛耐藥是結核病藥物治療面臨的嚴重挑戰。耐多藥是菌株至少同時對異煙肼、利福平耐藥；廣泛耐藥是菌株對異煙肼、利福平耐藥，同時對任何氟喹諾酮類藥物耐藥，以及至少對1種二線抗結核病藥物（卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星）耐藥。本地區耐多藥菌株對一線抗結核病藥物乙胺丁醇和鏈霉素的耐藥率分別為67.6%和52.9%，提示本地區耐多藥菌感染治療在一定程度上主要依靠二線抗結核病藥物。本研究中，菌株對二線抗結核病藥物卡那霉素的耐藥率最低，建議臨床予以關注；菌株對卡那霉素、卷曲霉素的耐藥率不高，可用于組成耐多藥治療方案；對氨基水楊酸、丙硫異煙胺也可作為制定耐藥方案所選擇的藥物，但因其本身屬于抑菌藥物，對結核病的治療作用有限。

本研究中，MTBC耐藥譜構成呈現出多態性和復雜性。耐多藥譜共11種組合，其中異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇（41.2%）與異煙肼+利福平+鏈霉素+乙胺丁醇+氧氟沙星（14.7%）組合最為常見，因此在制定耐多藥治療方案時，特別是制定標準化治療方案時，應充分考慮菌株對這幾種藥物的耐藥情況，調整治療方案。

本研究中，雖然廣泛耐藥菌株僅有1株，但提示其已經產生或開始傳播，可能對本地區結核病防控形成威脅，廣泛耐藥結核病不但抗藥性更強，治療上比耐多藥結核病更為困難，早發現和積極防控是關鍵。

綜上所述，本地區MTBC耐藥譜的多態性和復雜性，一方面提示耐藥成因復雜，另一方面也在一定程度上提示標準化治療方案可能難以覆蓋足夠的耐藥譜型，應開展體外藥物敏感性試驗，尤其是開展耐藥分子生物學檢測，根據檢測結果設計個體化治療方案應成為耐藥結核病治療的首選。