姜黃素對腦出血模型大鼠認知功能以及海馬區細胞凋亡的影響

徐 鵬， 葉 蕓， 喬 鵬

腦出血危害人類健康的重大疾病，因腦出血引發的癡呆發生率很高(從5%～44%不等)。研究發現，腦出血后的認知功能障礙既包括急性出血性病變導致的即刻認知功能障礙，也包括彌漫性血管和非血管病變緩慢積累導致的進行性認知功能障礙[1]。Charlotte Cordonnier等對417例腦出血患者進行研究發現，16%的患者存在既存性癡呆，在重度腦出血患者中，既往癡呆的發生率高達23%[2]。腦出血患者中較高的既往癡呆發生率可能是由潛在的淀粉樣變病理所致[3]，其病變在大腦中海馬區的損傷最為重要。

海馬神經元凋亡在腦出血、血管性癡呆、阿爾茨海默病發病中均起著重要的作用[4]。神經元凋亡受多種因素影響，如Bcl-2、Bax、caspases、活性氧(ROS)等。Bcl-2和caspases-3是已被認知的兩個參與細胞凋亡的關鍵調控分子，抑制Bcl-2的表達，提高Bax的表達可以激活p53和caspases-3，將誘導大鼠海馬神經元凋亡[5～7]。

姜黃素是從姜黃中分離得到的一種天然多酚類物質。大量研究表明，姜黃素具有抗氧化、抗炎、免疫調節和神經保護活性等生物學和藥理特性，被認為是一種潛在的治療延遲和治療各種與年齡有關的慢性疾病的藥物，越來越受到人們的關注[8～10]。然而目前對姜黃素參與調控海馬神經元凋亡因子表達和學習記憶能力的影響卻少有報道。

為了尋找更有效、毒性更小的新型抗腦出血的藥物或營養補充劑，本研究選用姜黃素作為活性因子，建立腦出血大鼠模型來評價姜黃素對腦出血大鼠模型的認知和海馬區細胞凋亡作用及探索其作用機制，探索姜黃素輔助治療是否可以替代傳統藥物對腦出血引發的功能損傷提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物 動物試驗根據實驗動物使用指南進行，實驗方案已得到動物護理和使用委員會的批準。在本研究中選用從北京維通利華實驗動物技術有限公司購買的24只12個月大的C57BL/6雄性大鼠作為研究對象，在這個年齡大鼠衰老的腦血管作用已經完全發育成熟，飼養過程中維持12 h的光/暗循環，并且可以自由獲得水和食物。

1.2 試劑與儀器 Aβ25-35 (批號:Y-0044) 購買于BIOSS生物科技有限公司(北京，中國)；TUNEL凋亡檢測試劑盒購買于BOSTER生物科技有限公司(武漢，中國)；An RT-PCR試劑盒購買于TransGen生物科技有限公司(北京，中國)；Anti-Bcl-2、anti-Bax與anti-β-actin抗體購買于Bio-Rad實驗室(伯克利，美國)；MT-2000Morris水迷宮購買于成都泰盟科技有限公司(成都，中國)；戊巴比妥(批號:76-74-4)、多聚甲醛(批號:30525-89-4)、氯仿(批號:67-66-3)、乙醇(批號:64-17-5)；異丙醇(批號:67-63-0)等常規試劑均購買于美國Sigma公司；LDH 檢測試劑盒(建成生物工程研究所，中國)；細胞色素C釋放凋亡測定試劑盒(BioVision，美國)；Sepharose凝膠(Invitrogen公司，美國)；紫外分光光度計(Beckman-Coulter DU-640，美國)；DL500 DNA(Invitrogen，美國)；倒置顯微鏡S70購自Leica DMIRB(Lognes，法國)；ChemiDocXRS凝膠成像分析系統購自Bio-Rad實驗室(伯克利，美國)；免疫組化試劑盒購自北京ZSGB生物工程有限公司(中國，北京)；TC-512PCR擴增儀購自Techen(倫敦，英國)。

1.3 腦出血動物建模 用異氟醚麻醉大鼠并放置于立體定向的框架中，在做頭皮中線切口之前在頭皮下注射利多卡因。試驗中使用無菌技術在大鼠前囪的外側(一半在前囪的左側，一半在前囪的右側)和0.0 AP水平處鉆一個3.0 mm的孔，將一根26號針插入6.0 mm的深度，分別將1.0 L的無菌生理鹽水(n=8)和0.10 U(n=16)細菌膠原酶按常規注射法注入超過5 min，做為假手術組和腦出血患病大鼠[11～13]，針留在原處停留5 min以防止回流，隨后縫合傷口。在整個手術和恢復期間，使用直腸溫度探頭和加熱毯，使大鼠體溫被維持在37.0 ℃±0.5 ℃。

1.4 實驗處理 所有藥物治療均于術后第21天開始，將ICH建模大鼠隨機分為兩組，一組給予姜黃素(120 mg/kg，480 mg/kg)作為姜黃素(Cur)處理組;另一組作為模型組(0.005%乙醇/生理鹽水)。在膠原酶注射前及注射后1 d、3 d分別測量體重。體重變化百分比按公式計算：體重變化百分比(%)=(出血性后各時間點-出血性前體重)/出血性前體重×100。

1.5 Morris水迷宮實驗 本研究采用Morris水迷宮法對空間學習記憶能力進行測定。試驗是在一個圓形的白色塑料水池中進行(直徑94 cm，深度31 cm)，里面裝滿了水(深度30 cm)和3000 ml脫脂牛奶，測試時溫度保持在25 ℃±1 ℃。逃生平臺是一個25 cm2的有機玻璃廣場，位于游泳池的一個象限的中心，距離泳池邊緣15 cm，并淹沒在液面下方1 cm。

1.5.1 隱藏的平臺測試 每只老鼠頭部標注黃色，背帶著亞硝基黃原酸，在一個圓形池對小鼠進行訓練，一個隱藏的平臺將圓形池隨機分為4個象限，每次試驗120 s，間隔30 min，連續5 d。通過在線圖像視頻跟蹤系統記錄大鼠尋找平臺的時間，并在120 s內作為逃逸潛伏期。

1.5.2 空間探針實驗 隱藏平臺實驗結束后將平臺從池中取出，老鼠被留在距離主平臺最遠的水池的四分之一處，通過在線圖像視頻跟蹤系統記錄大鼠通過平臺的次數、平臺象限停留時間、平臺象限的總距離的百分比。

1.6 神經行為評分 姜黃素處理5 d后，對不同組處理的大鼠的神經行為進行行為評分，具體評分標準如下：0分:無任何神經功能缺損癥狀；1分：提尾懸空后，大鼠前肢腕肘屈曲，肩內旋，肘外擴，緊貼胸壁，沒有其他不正常行為；2分：將大鼠放在光滑的平面上，橫向推動大鼠肩部使其向前方移動，肢體阻力減小，同時伴有前肢彎曲動作，無轉圈行為；3分：大鼠自由活動時會發生環轉或轉圈；4分：肢體軟癱，肢體無法進行自發活動。分值越高表明神經功能缺損越嚴重。

1.7 大鼠海馬神經元組織病理學檢查 將大鼠腹腔注1.0%的戊巴比妥，灌注4%多聚甲醛固定腦24 h，隨后將腦組織取出稱重，固定在10%的中性福爾馬林緩沖液中，脫水后使用石蠟將其封裝在冠狀切片中，隨后H&E染色，在光學顯微鏡下(400×)進行病理研究。實驗中仔細觀察凋亡細胞的明顯形態學特征，包括細胞核凝結和碎裂情況。由于凋亡細胞在細胞核內呈褐色，采用石蠟切片TUNEL免疫組織化學染色法相結合計算凋亡細胞指數。凋亡指數的計算方法為隨機選取100個神經元細胞中凋亡細胞的百分比，采用GD-10.0圖像分析系統計算凋亡細胞陽性率。

1.8 大鼠腦組織RNA分離及caspase-3 mRNA分析 大鼠腦組織麻醉后，注射1.0%戊巴比妥麻醉。按照文獻中描述的一般步驟，用TRIzol對組織總RNA進行分離和提取。純度：A260/280為1.91-2.19，A260/230為1.98-2.31；而濃度> 0.2 μg/μl，使用1 μg RNA進行逆轉錄生成cDNA。PCR產物在0.1%瓊脂糖凝膠電泳的DL500DNA標記，采用β-actin作為空白，凝膠成像后定量分析。

1.9 細胞培養 PC 12細胞購買于中國典型培養物保藏中心(CCTCC，湖北武漢)杜爾貝克補充5%胎牛血清、10%馬血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素，在改良的培養基沖入CO2(5% CO2，37 ℃)培養，每3～5 d更換一次新的培養基。

1.10 Western blotting分析PC12細胞中Bcl-2和Bax蛋白的表達 PC12細胞培養在密度為1.0×105six-well中(2.0 ml)與20 μmol/L Aβ25-35在CO2培養箱中反應12 h以建立的細胞模型，隨后將細胞隨機分為5組，使用血清DMEM培養基沖洗，培養基(空白)或含有20 μmol/L Aβ25-35的姜黃素(120 mg/kg，240 mg/kg，480 mg/kg)反應12 h，假手術組PC12細胞也用無血清的DMEM培養基沖洗，并作為對照處理組。Bax與Bcl-2蛋白表達量采用Quantity One System，Bcl-2、Bax的比率以Bax/β-actin和Bcl-2/β-actin計算。

2 結 果

2.1 姜黃素對腦出血大鼠空間學習記憶能力的影響 Morris水迷宮試驗是被廣泛使用的用于評估空間學習和記憶認知的經典方法，在本文中我們采用Morris水迷宮試驗對大鼠建模后的空間學習和記憶能力開展了研究，不同處理組在Morris水迷宮中探測的運動軌跡(見圖1)。

與假手術組相比，模型組大鼠的逃避潛伏期明顯延長(見表1)，而分別給予120、480 mg/(kg·d)的姜黃素(Cur)處理的腦出血大鼠與模型組大鼠相比，2 d后大鼠的逃避潛伏期均顯著降低(P<0.01)。此外，與假手術組大鼠相比，模型組大鼠在穿越平臺次數、目標象限停留時間、平臺象限的總距離的百分比3個方面均明顯降低(P<0.01)(見表2)，而Cur處理組與模型組相比顯著增加(P<0.01)。這些結果揭示姜黃素能顯著提高腦出血大鼠的空間學習和記憶認知能力。

2.2 姜黃素對腦出血大鼠神經元凋亡的影響 腦出血的病理改變和神經元損傷是海馬神經元細胞的凋亡關鍵因素。大鼠海馬神經元細胞微觀結構及凋亡百分比，假手術組的神經元凋亡比例為(8.1±1.07)%，而模型組高達(65±1.23)%，采用120、480 mg/kg姜黃素處理后神經元凋亡比例下降為(36.50±2.43)%、(15.00±2.51)%，這一結果表明神經元凋亡在腦出血患者中起重要作用，能有效抑制神經元凋亡(見圖2)。

2.3 姜黃素對腦出血大鼠神經元組織caspase-3 mRNA、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響 對大鼠腦組織RNA分離及caspase-3 mRNA分析，數據顯示患病組大鼠神經元組織caspase-3的mRNA表達明顯高于假手術組大鼠(P<0.01)。與模型組相比，姜黃素處理(120、480 mg/kg)顯著降低了腦出血大鼠caspase-3 mRNA的表達(P<0.01)。試驗中進一步通過建立細胞模型評估不同處理對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響，以探討細胞凋亡通路相關的可能機制。研究結果發現，在120 mg/kg、480 mg/kg濃度下姜黃素處理細胞模型12 h，顯著下調Bax蛋白的表達水平(P<0.01)并且上調Bcl-2蛋白的表達水平(見表3)。與假手術組相比，模型組Bcl-2/Bax的相對比例顯著下降(P<0.01)，而經120 mg/kg、480 mg/kg濃度姜黃素處理后，這一比值由0.3顯著提高至0.7、1.4(P<0.05)。這些結果表明，姜黃素的抗腦出血作用可能與Bax和Bcl-2的蛋白表達參與抑制細胞凋亡的機制相關。

表1 姜黃素對逃避延遲的影響

表2 姜黃素對穿越平臺次數的影響

表3 姜黃素對蛋白表達的影響

3 討 論

腦出血是一種致命的卒中，不僅會導致患者死亡，還是會對幸存者造成長期的神經或認知損傷，現階段用于腦出血治療的藥物只能緩解患者的癥狀，并不能起到延緩病的發展或治愈疾病的功效，目前仍缺乏有效的治療方法。為了尋找更有效、毒性更小的新型抗腦出血的藥物或營養補充劑，本研究選用姜黃素作為活性因子，建立腦出血大鼠模型來評價姜黃素對腦出血大鼠模型的認知和海馬區細胞凋亡作用。研究結果發現，Morris水迷宮試驗證實與患病組大鼠相比，姜黃素處理的大鼠具有較短的脫逃潛伏期，穿越平臺次數、平臺象限停留時間、平臺象限的總距離的百分比顯著增加，姜黃素能改善腦出血大鼠的認知功能。

從腦出血動物模型的基礎研究和臨床資料中積累的證據表明，神經元損傷和丟失是神經元凋亡的關鍵因素，細胞凋亡阿爾茨海默病和其他許多慢性神經退行性疾病中患者的神經系統發育起著重要作用，細胞凋亡主要通過線粒體途徑和外源性途徑兩種途徑(死亡受體介導)通路。固有的凋亡過程發生在線粒體中，主要影響Bcl-2家族和caspases[14,15]。細胞凋亡的外在途徑包括死亡信號的相互作用(如TNF-α TNFR1)和caspase-8裂解procaspase-3使其激活。Bcl-2家族由促凋亡蛋白(Bax、Bad和Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2和Bcl-xL)組成。不良反應可增加線粒體通透性，釋放促凋亡因子，并通過抑制抗凋亡的Bcl-2家族蛋白觸發caspase信號通路，進而導致神經元凋亡。促凋亡蛋白(如Bax)與抗凋亡蛋白(如Bcl-2)的比例直接決定了細胞線粒體外膜各通道的開放程度和對凋亡的調控。Caspase-3是細胞凋亡的重要調控因子，其激活被認為是細胞凋亡過程中的關鍵步驟。活化的caspases裂解多種靶蛋白，導致細胞中DNA片段的破壞，最終導致細胞的凋亡。

本研究發現，神經元細胞凋亡在腦出血的發病機制中扮演著重要角色，姜黃素可以顯著抑制神經細胞凋亡。此外，我們還分析了神經組織caspase-3 mRNA和Bcl-2在PC12細胞中的表達，結果表明患病組caspase-3表達顯著增加，而姜黃素能顯著降低患病鼠caspase-3 mRNA和Bax蛋白的表達，同時增加Bcl-2/Bax的比值和Bcl-2蛋白的表達，這些研究結果揭示姜黃素可通過抑制神經元凋亡信號通路改善腦出血模型大鼠認知功能，預防神經元損傷。但目前尚不清楚姜黃素對大鼠神經元的保護作用是直接通過調控凋亡通路發揮作用還是通過細胞凋亡后IR的進一步改善來實現的，這部分機制需要進一步開展相應的研究。

然而，姜黃素對caspase-3、Bax、Bcl-2表達的顯著影響顯示，姜黃素的抗腦出血作用也可能與線粒體通透性、CytC、PI3K/Akt信號通路有關。因此，后續研究仍需進一步開展姜黃素對神經退行性變中神經元凋亡相關分子通路的作用機制工作。

圖1 不同處理組在Morris水迷宮中探測的運動軌跡。A、B、C、D分別為假手術組、模型組、Cur 120 mg/kg處理組、Cur 480 mg/kg處理組

圖2 不同處理對大鼠海馬神經元細胞凋亡的影響。A、B、C、D分別為假手術組、模型組、Cur 120 mg/kg以及Cur 480 mg/kg處理組細胞凋亡微觀結構