癲癇伴發抑郁大鼠杏仁核突觸相關蛋白的表達

曹真真， 閆桂柳， 朱含笑， 李漾超， 李 云

癲癇(epilepsy)是一種大腦神經元突發異常放電，發作具有重復性、發作性、短暫性、刻板性特點的神經系統疾病[1]。抑郁(depression) 是以情緒低落為主要表現的社會功能障礙性疾病。癲癇伴發抑郁(epilepsy-associated depression,EAD)是癲癇患者常見的并發癥之一。Fiest等發現癲癇患者中，抑郁患病率高達23.1%，而終身抑郁癥患病率達4.1%～32.5%[1]。近年來，EAD的發病率仍在持續升高，抑郁對于患者的影響遠遠大于癲癇本身，不僅影響患者的生存質量，而且加重家庭經濟負擔，甚至導致患者自殺。現已有研究認為，癲癇與抑郁發病機制存在潛在共同點，但具體機制并不明確。

近年來研究突觸可塑性及其相關蛋白與神經精神障礙性疾病的相關性的報道越來越多，多種突觸相關蛋白能夠協同維持突觸的功能及調控神經遞質的釋放，從而影響神經精神疾病的發病[2]。神經生長相關蛋白(Growth-associated protein-43，GAP-43)是一種神經組織上的特異性磷蛋白。突觸素(Synaptophysin，SYN)是作為突觸發生和突觸重塑的重要標記的一種鈣結合糖蛋白[3]。突觸后致密蛋白(Postsynaptic density95，PSD95)是突觸后致密物質的主要蛋白質成分之一，也是包含高濃度谷氨酸受體、信號蛋白、細胞骨架元素的一種有機結構[4]。既往有研究發現，突觸相關蛋白GAP-43、SYN、PSD95在癲癇發病過程中表達水平明顯下降，這提示GAP-43、SYN、PSD95在癲癇的發生機制中起重要作用。本課題組前期的研究發現，腦源性神經營養因子(brain derived neurotrphic factor,BDNF)及其受體TrKB在癲癇伴抑郁發病中具有重要作用，已知BDNF可促進損傷神經元的再生，并參與突觸重塑和神經遞質傳遞的功能，在癲癇伴抑郁的發病過程中發揮了重要作用[5,6]。但突觸相關蛋白對于癲癇伴抑郁的影響相關文獻仍較少。基于上述事實，本課題擬進一步探討EAD大鼠杏仁核突觸相關蛋白的表達變化，以闡述突觸相關蛋白與EAD發病的關系。

1 材料與方法

1.1 動物及試劑 選用健康清潔級成年SD大鼠，體質量(250±50)g，由大理大學動物實驗中心提供[動物質量合格證: SYXK(滇) 2018.0002]。實驗過程中，對動物的處置符合大理大學第一附屬醫院倫理委員會關于使用實驗動物的倫理學標準。實驗中使用的免疫組織化學染色試劑包括試劑一(3%內源性過氧化氫酶阻斷劑)、試劑二(反應增強劑)、試劑三(增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物)，一抗為(GAP-43、SYN、PSD95)和羊血清，其中一抗與磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)按1∶100配制，GAP-43、SYN、PSD9購自Millipore公司，PV900試劑盒(北京中杉)，羊血清購于北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠模型及分組 本實驗于 2019年1月-2020 年12月在大理大學科研實驗中心完成。采用Open-field法進行行為學評分，篩選評分大致相似的大鼠，隨機將成年SD大鼠分為4組，正常組、抑郁組、共病組、癲癇組。正常組:大鼠正常條件飼養;抑郁組:采用慢性不可預見的中等應激刺激動物(chronic unpredictable mild stress,CUMS)結合孤養法建立大鼠慢性應激抑郁模型[7];癲癇組和共病組:參考文獻[8]建立成熟的氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型，建模過程為:予大鼠腹腔注射氯化鋰(3 mmol/kg)，20 h～24 h后腹腔注射匹羅卡品(10 mg/kg)，30 min后未達到癲癇發作的大鼠，再次給予匹羅卡品(10 ml /kg)，至極量為60 mg/kg，直至大鼠出現Ⅳ級以上的癲癇大發作。大鼠出現Ⅳ級以上的發作并持續 60 min 定為模型制作成功的標準，同時給予腹腔注射地西泮(4 mg/kg)控制發作，以防止大鼠抽搐過度致死。癲癇模型造模后14 d，對大鼠進行篩選，將符合抑郁指標的大鼠作為共病組，每籠1只飼養。造模成功后，各組大鼠常規腹腔注射青霉素預防感染。實驗大鼠均成功造模和存活。

1.2.2 大鼠造模成功的標準 癲癇模型建立后，采用Racine評分標準評級癲癇行為:0 級:無任何反應;Ⅰ級: 面部抽搐，包括眨眼、動須、節奏性咀嚼等;Ⅱ級:Ⅰ級行為表現加節律性點頭;Ⅲ級:Ⅱ級行為表現加前肢肌陣攣，但無后肢直立位;Ⅳ級:Ⅲ級行為表現加后肢直立位;Ⅴ級: 全面性強直-陣攣發作，并失去肢體控制。大鼠出現Ⅳ級以上的發作時間大于60 min，并持續發作，毛發失去光澤，體質量減輕，活動減少，蜷縮少動，快感缺失，自發活動和探究性活動減少則可認為EAD造模成功。動物行為學評價：(1)體重的測量：監測癲癇大鼠在癲癇發作后第1天、第8天、第15天、第29天及各對照組大鼠同一時間點體重變化情況;(2)蔗糖水試驗： 癲癇大鼠在造模后第1天、第8天、第15天、第29天及各對照組大鼠，每隔1 w進行禁水24 h，測定禁水24 h后的第1小時內動物飲用1%蔗糖溶液的量(蔗糖溶液的飲用量反映了大鼠對獎賞的快感反應)；(3)曠野試驗：擬用敞箱長寬均為 100 cm、高為 50 cm，內空的立柱體，壁周為黑色，地面用黑線劃分為面積相等的25塊。以動物穿越地面方塊數(四爪跨入)作為水平活動得分(反映大鼠的運動活動性水平)，以直立次數(兩前肢離地1 cm以上)為垂直活動得分(反映大鼠興趣減少程度)。行為學評價結果顯示: 應激后各組大鼠不同時間比較體質量減輕、蔗糖溶液消耗量減少、曠場實驗水平運動距離及垂直運動距離縮短(P<0.05)；在CUMS 后第29天與1 d、8 d、15 d比較，抑郁組、共病組大鼠以上各指標降低(P<0.05)(見圖1)，則進一步說明EAD模型建立成功。

1.2.3 組織制備 各組大鼠分別于造模成功后第29天取材，采用活體灌注固定取腦法取腦組織。免疫組織化學染色法檢測杏仁核突觸相關蛋白(SYN、PSD95、GAP43)，抗體濃度為1%:用3.6%水合氯醛(1 ml/100 g)腹腔麻醉大鼠，首先用生理鹽水從左心室開始灌洗，然后灌注4%多聚甲醛，斷頭取腦，并于冠狀面上切取大鼠大腦杏仁核0.5 cm，用冰凍石蠟切片機連續冠狀切片，片厚約8 μm。免疫組化二步法進行檢測，最后采用光學顯微鏡拍照，在每只動物杏仁核區選擇高倍視野(HPF，400×)，計數突觸相關蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫陽性細胞數量。

1.2.4 免疫組織化學染色 將上述切片自然干燥，放入60 ℃烤箱烤2.5 h后，自然降溫，再次放入65 ℃烤箱烤30 min，經二甲苯脫臘、梯度乙醇水化、高壓修復后冷卻，使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)漂洗，使用內源性過氧化氫酶阻斷劑阻斷內源性過氧化物酶后，再次使用磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)漂洗，使用羊血清封閉非特異性的抗原抗體反應1 h后，加入一抗-4 ℃過夜，次日磷酸鹽緩沖(Phosphate buffer solution,PBS)充分漂洗后滴加反應增強劑室溫孵育30 min，再次磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffer solution,PBS)充分漂洗后加入適量新鮮配置的DAB顯色，自來水沖洗后，使用蘇木素染色液復染，梯度酒精脫水后，二甲苯透明、中性樹膠封片。每只大鼠選不連續的5張切片，采用光學顯微鏡進行拍片。每張切片400×拍照5個視野，雙盲計數杏仁核免疫陽性細胞數。

2 結 果

2.1 各組大鼠杏仁核突觸相關蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫陽性細胞定位表達情況 光學顯微鏡顯示，各組大鼠大腦杏仁核均有突觸相關蛋白GAP43、SYN、PSD95的表達，3種因子免疫陽性細胞呈棕黃色，定位在神經元胞質及突起根部。

2.2 各組大鼠杏仁核突觸相關蛋白(GAP43、SYN、PSD95)免疫陽性細胞數對比 單因素方差分析(one-way ANOVA)結果顯示，與各對照組相比，共病組GAP-43及PSD95免疫組化陽性細胞數最少，正常對照組最多(P<0.05)；其余各組相比差異無統計學意義(P>0.05)。共病組和抑郁組與癲癇組及正常組相比，SYN免疫組化陽性細胞表達均減少(P<0.05)；癲癇組較抑郁組增多，較正常組減少(P<0.05)(見表1、圖2)。

表1 各組大鼠大腦杏仁核GAP-43、SYN、PSD95免疫陽性細胞數比較

與正常組同時間比較▲P<0.05；與癲癇組同時間比較▽P<0.05

各組大鼠杏仁核陽性細胞表達變化：A:正常組GAP43陽性細胞表達；B:抑郁組GAP43陽性細胞表達；C:癲癇組GAP43陽性細胞表達；D:共病組GAP43陽性細胞表達；E:正常組PSD95陽性細胞表達；F:抑郁組PSD95陽性細胞表達；G:癲癇組PSD95陽性細胞表達；H:共病組PSD95陽性細胞表達；I:正常組SYN陽性細胞表達；J:抑郁組SYN陽性細胞表達；K:癲癇組SYN陽性細胞表達；L:共病組SYN陽性細胞表達

3 討 論

杏仁核位于大腦邊緣系統，是參與情緒調節的重要結構，在識別、評估情緒刺激以及針對刺激產生的特定情緒中發揮關鍵作用[9,10]。Richardson等[11]研究發現杏仁核體積的改變在EAD的發病中起關鍵作用。本團隊前期的實驗發現EAD模型大鼠杏仁核中有大量神經元凋亡的現象[5]，由此可見杏仁核與EDA的發生密切相關。越來越多的研究發現，EAD的發生機制可能與神經突觸可塑性的改變相關。GAP-43是存在于神經細胞膜上的一種特異性磷酸蛋白，主要分布于大小腦、脊髓、背根節以及自主神經系統的神經元內,并且只存在于已分化成型且開始突觸生長的神經元中[12]。GAP-43對于突觸功能的維持、軸突生長及神經遞質的釋放起著關鍵作用[13]，同時也是神經元生長和發育的內在決定因子之一[14]。SYN是一種特異性鈣結合酸性蛋白[15]。主要表達于中樞和外周神經系統所有神經末梢，同時在神經內分泌細胞也可見部分表達[16]。最近研究表明，SYN不僅調節成熟神經末梢的神經遞質的釋放，同時調節神經末梢的形成和生長，SYN在囊泡融合和神經遞質的釋放中起著關鍵作用[17]。張明磊等[3]研究中提到SYN通過酪氨酸激酶使突觸素磷酸化調節神經遞質的釋放，從而影響突觸可塑性。PSD是一層均質的存在于突觸后膜內側胞質面的物質，對于突觸可塑性至關重要，而PSD95是興奮性突觸后致密物質(PSD)中的含量豐富的重要蛋白之一。PSD95被認為是興奮性突觸的突觸后特異性標記物，同時能夠促進谷氨酸受體的傳遞和參與抑郁癥的發病[18]。目前杏仁核中突觸相關蛋白GAP-43、SYN、PSD95是否在EAD中發揮重要作用未見相關報道。

GAP-43、SYN、PSD95與抑郁癥的發病密切相關。Lang等[19]提到，抑郁癥的神經營養假說認為情緒和記憶相關的腦區神經可塑性降低、神經元萎縮和神經發生異常能夠影響抑郁狀態的發生。同時大量證據表明，抑郁癥可以導致突觸的形式和功能發生了區域特異性變化，突觸相關蛋白的表達發生了改變[20]。綜上所述，GAP-43、SYN、PSD95均可影響突觸可塑性，從而影響抑郁癥的發病。LUO等人[21]的研究發現，慢性不可預見性溫和應激大鼠表現出抑郁行為與杏仁核PSD-95及SYN表達顯著減少相關。本研究結果顯示，與正常組對比，抑郁組及共病組杏仁核GAP-43、PSD95及SYN免疫陽性細胞數表達均低于正常組，共病組與抑郁組SYN比較免疫陽性細胞表達增加，而共病組與抑郁組GAP-43、PSD95比較差異無統計學意義，提示在抑郁大鼠中杏仁核GAP-43、PSD95及SYN表達降低，則杏仁核GAP-43、SYN、PSD95降低可能提示EAD的發病。

在劉杰等[22]的研究中的實驗造模成功后采用RT-PCR 檢測方法發現15 d 時發作組GAP-43 mRNA的表達明顯高于其他對照組，但癲癇狀態逐漸穩定后，隨著苔蘚纖維出芽、突觸重塑停止，至30 d時GAP-43 mRNA的表達明顯下降。這表明GAP-43的表達下降與大鼠癲癇發作相關。文獻報道[15]，SYN與神經纖維出芽和突觸重塑的關系密切，從而參與癲癇的發病。張杰等[23]實驗中發現，氯化鋰-匹羅卡品癲癇大鼠模型中PSD95表達下調，提示PSD95在癲癇的發病中發揮重要作用。綜上所述，突觸相關蛋白GAP-43、SYN、PSD95在癲癇的發病機制中發揮重要作用，并影響其發病。本研究結果顯示，與正常組對比，癲癇組與共病組杏仁核GAP-43、PSD95及SYN免疫陽性細胞數表達均減少，共病組與癲癇組對比SYN免疫陽性細胞表達升高，而共病組與癲癇組比較GAP-43、PSD95比較差異無統計學意義，癲癇大鼠杏仁核中GAP-43、SYN、PSD95表達的降低提示可能與EAD的發病相關。

綜上，本研究結果為進一步深入探討突觸可塑性在EAD發病機制及闡明杏仁核在PSD發病中的作用提供了實驗依據。后續研究需進一步探討EAD大鼠杏仁核突觸相關蛋白GAP-43、SYN、PSD95蛋白的定量表達及模型大鼠行為學改變情況信號通路的表達情況。