NLRP3炎癥小體的表達(dá)及多態(tài)性與急性冠脈綜合征患者Caspase-1水平和冠脈病變程度的關(guān)系研究

吳 蔚 王曉萍 孫 琳 倪 青 邵 冰 張 晶 田 鑫

沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心血管一病房，遼寧沈陽 110002

急性冠脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是在冠狀動脈粥樣硬化基礎(chǔ)上發(fā)展而來的臨床綜合征，其發(fā)生、發(fā)展過程中冠狀動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性降低，而炎癥反應(yīng)的激活、內(nèi)皮功能的損傷與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，且炎癥反應(yīng)還能加重內(nèi)皮損傷[1-2]。因此，炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是ACS 病情發(fā)展變化的核心環(huán)節(jié)，但目前關(guān)于ACS 患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制尚未明確。Nod 樣受體蛋白3（nodlike receptor protein 3，NLRP3）炎性小體是體內(nèi)炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)機(jī)制，其能夠激活caspase-1[3-4]。NLRP3 基因rs10754558 位點多態(tài)性被認(rèn)為是造成ACS 患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)異常激活的重要因素[5-6]。本研究旨在分析ACS 患者體內(nèi)NLRP3 的表達(dá)及基因rs10754558 位點多態(tài)性與Caspase-1水平和冠脈病變程度的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月～2019年5月在沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科住院的150 例臨床診斷為ACS 的患者作為實驗組，選取同期的疑似冠心病入院但行選擇性冠狀動脈造影術(shù)檢查陰性的50 例患者作為對照組。ACS 確診標(biāo)準(zhǔn)：參照美國《2014 AHA/ACC Guideline for the Management of Patients With Non-ST-Elevation Acute Coronary Syndromes：A Report of the American College of Cardiology/American Heart Association Task Force on Practice Guidelines》[7]及《急性冠脈綜合征急診快速診治指南（2019）》[8]中的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合ACS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②所有ACS 患者住院期間行冠狀動脈造影和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能耐受冠狀動脈造影和經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)的患者；②合并嚴(yán)重肝腎功能異常者；③不愿意參與本研究者。所有入選個體在入選時均向本人及家屬告知本研究方法及其意義，做到知情同意，并簽署知情同意書。本研究經(jīng)沈陽醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。實驗組中，男84 例，女66例；年齡54～65 歲，平均（56.13±4.55）歲；不穩(wěn)定型心絞痛76 例，急性非ST 段抬高心肌梗死35 例，急性ST 段抬高心肌梗死39 例。對照組中，男32 例，女18 例；年齡55～65 歲，平均（56.32±4.17）歲。兩組的性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本的采集及檢測 ACS 組和對照組患者入院時進(jìn)行外周血采集，共采集5 mL，采用全血基因組提取試劑盒（洛陽愛森生物科技有限公司）分離基因組DNA，設(shè)計針對rs10754558 位點的引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)，得到的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行基因測序以判斷rs10754558 位點的多態(tài)性。采用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PT-PCR）檢測各組冠狀動脈造影前外周靜脈血中NLPR3 和Caspase-1 的表達(dá)水平。分離外周靜脈血，提取單核細(xì)胞，同時提取測定單核細(xì)胞總RNA，其中逆轉(zhuǎn)錄過程嚴(yán)格遵照Thermo 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒[杰輝生物（北京）科技發(fā)展有限公司]步驟進(jìn)行，應(yīng)用Western Blot 方法進(jìn)行PCR 產(chǎn)物的測定。

1.2.2 冠脈病變程度檢測 所有入選的患者入院后均在局部消毒麻醉后，采用Seldinger 技術(shù)穿刺右側(cè)橈動脈（若穿刺困難可經(jīng)右側(cè)股動脈），采用Judikins 方法進(jìn)行常規(guī)多體位左右冠狀動脈造影檢查，觀察冠脈病變情況（包括病變分支及各分支的狹窄程度）。

1.3 觀察指標(biāo)及評價標(biāo)準(zhǔn)

比較兩組患者的NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平，根據(jù)冠狀動脈造影檢查結(jié)果，記錄不同冠脈病變支數(shù)的NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分；觀察不同NLRP3 基因型患者的冠脈病變情況，分析NLRP3表達(dá)及多態(tài)性與急性冠脈綜合征患者Caspase-1水平和冠脈病變程度的關(guān)系。Gensini 評分是根據(jù)冠狀動脈造影檢查對各分支狹窄程度（狹窄直徑與健康血管直徑所成百分比）進(jìn)行評分，用于判斷冠脈病變狹窄程度，其中無狹窄為0 分，＜25%為1 分，25%～50%為2 分，＞50%～75%為4 分，＞75%～90%為8 分，＞90%～＜100%為16 分，100%為32 分，各分支評分之和即為Gensini 評分[9-10]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)或百分率表示，采用χ2檢驗；采用Pearson 相關(guān)性分析NLPR3 表達(dá)水平與Caspase-1 表達(dá)水平、Gensini 評分的相關(guān)性，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平的比較

實驗組的NLPR3 和Caspase-1 表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 兩組患者NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平的比較（±s）

表1 兩組患者NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平的比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05

組別例數(shù)NLPR3Caspase-1實驗組對照組150 50 1.33±0.43*0.58±0.03 2.45±0.52*1.57±0.06

2.2 實驗組不同冠脈病變支數(shù)NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分的比較

實驗組三支病變患者的NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分高于雙支病變及單支病變患者，雙支病變患者的NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分高于單支病變患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

2.3 NLPR3 表達(dá)水平與Caspase-1 表達(dá)水平、Gensini評分的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)性分析顯示，NLPR3 表達(dá)水平與Caspase-1 表達(dá)水平、Gensini 評分成正相關(guān)（r=0.714、0.781，P＜0.05）。

表2 實驗組不同冠脈病變支數(shù)NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分的比較（±s）

表2 實驗組不同冠脈病變支數(shù)NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分的比較（±s）

與單支病變比較，*P＜0.05；與雙支病變比較，#P＜0.05

病變支數(shù)例數(shù)NLPR3Caspase-1 Gensini 評分單支病變雙支病變?nèi)Р∽?6 53 61 1.01±0.02 1.46±0.14*1.69±0.21*#1.12±0.25 1.95±0.33*2.64±0.51*#22.19±3.17 30.05±3.22*44.81±2.86*#

2.4 兩組患者NLRP3 多態(tài)性的比較

實驗組中NLRP3 基因rs10754558 位點基因型中，CC 基因型44 例（29.33%），GG 基因型46 例（30.67%），GC 基因型60 例（40.00%）；對照組NLRP3 基因rs10754558 位點基因型中，CC 基因型40 例（80.00%），GG 基因型4 例（8.00%），GC 基因型6 例（12.00%）。實驗組NLRP3 基因中的GG 基因型和GC 基因型所占比例高于對照組，CC 基因型的所占比例低于對照組（P＜0.05）。

2.5 實驗組NLRP3 的多態(tài)性與不同冠脈病變支數(shù)的關(guān)系分析

實驗組中，三支病變多見于NLPR3 的GG 型和GC 型（表3）。

表3 實驗組NLRP3 的多態(tài)性與不同冠脈病變支數(shù)的關(guān)系分析[n（%）]

3 討論

NLRP3 炎性小體能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥反應(yīng)，其由NLRP3、CARD、Caspase-1、ASC 組成，活化的NLRP3可以與CARD8 相互作用激活Caspase-1[11-12]。NLRP3基因rs17054558 位點的多態(tài)性會影響NLRP3 的功能，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的改變[13-15]。Gensini 評分是用于判斷冠脈病變狹窄程度的評分方法。本研究結(jié)果顯示，實驗組三支病變患者的NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分高于雙支病變及單支病變患者，雙支病變患者的NLPR3、Caspase-1 表達(dá)水平及Gensini 評分高于單支病變患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）提示NLRP3、Caspase-1 表達(dá)水平與ACS 的病變程度具有相關(guān)性。Pearson 相關(guān)性分析顯示，NLPR3 表達(dá)水平與Caspase-1 表達(dá)水平、Gensini 評分成正相關(guān)（r=0.714、0.781，P＜0.05），進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論。

本研究對NLRP3 基因rs10754558 位點多態(tài)性的基因型及等位基因進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示，實驗組NLRP3 基因中的GG 基因型和GC 基因型所占比例較對照組高，CC 基因型所占比例較對照組低（P＜0.05），提示NLRP3 基因rs10754558 位點GG 基因型和GC 基因型增多、等位基因G 增多與ACS 的發(fā)生密切相關(guān)，說明NLRP3 基因rs10754558 位點多等位基因G 增多會增強(qiáng)NLRP3 炎性小體的活性，通過炎癥反應(yīng)的激活造成ACS 患者發(fā)生內(nèi)皮功能損傷。本研究還顯示，實驗組中三支病變多見于NLPR3 的GG型和GC 型，進(jìn)一步說明等位基因G 增多與ACS 的發(fā)生密切相關(guān)。

綜上所述，NLRP3 基因rs10754558 位點的多態(tài)性與ACS 的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)；rs10754558 位點等位基因G 增多、GC 基因型和GG 基因型增多會增加炎性小體活性，能預(yù)示患者冠脈可能病變重，并且預(yù)后不良。