五氯苯酚對污泥急性毒性和菌群結構的影響

趙建國　徐永貴　李剛強　李玉　張珂　孫言卓

摘要：利用易于控制的序批式反應器（SBR）處理以甲醇為共代謝碳源的五氯苯酚（PCP）廢水，控制進水PCP質量濃度為10 mg/L，并設置僅以甲醇為碳源的對照組，利用發光菌急性毒性生物實驗和變性梯度凝膠電泳技術分別研究PCP對污泥急性毒性和菌群結構的影響，進而分析優勢菌群對污泥急性毒性的作用.結果表明，在第1—19 d期間，進水中的PCP（10 mg/L）會嚴重抑制污泥活性，導致污泥絮體解體，PCP難以被降解去除，出水化學需氧量（COD）質量濃度和污泥急性毒性顯著高于對照組;受PCP污染的污泥活性恢復較慢，在第20—32 d期間不再投加PCP和在第33—75 d期間補充投加2 mg/L PCP，進水COD和PCP的處理效果仍舊較差;吸附至污泥的PCP僅僅是引起污泥急性毒性升高的原因之一，受PCP誘導富集的優勢菌群在降解PCP過程中產生的代謝中間產物和分泌的次級代謝產物也是引起污泥急性毒性不可忽視的重要因素.

Abstract：A sequencing batch bioreactor （SBR） was used to treat pentachlorophenol （PCP） wastewater with the co-metabolic carbon source of methanol，and the influent PCP was controlled as 10 mg/L.In addition，another SBR only supplied methanol was set as control.The effects of PCP on sludge acute toxicity and microbial community were studied by the luminescent bacterium acute toxicity bioassy and denaturing gradient gel electrophoresis technique，and the function of dominant microbes on sludge acute toxicity was deeply analyzed.Results showed that during the period of 1-19 days，the sludge activity was significantly inhibited after injecting into 10 mg/L PCP in influent，the sludge flocs were disintegrated and the PCP was difficult to degrade.The effluent chemical oxygen demands （COD） and sludge acute toxicity under PCP stress were significantly higher than the control.The regeneration of sludge activity was slow due to the PCP contamination.No PCP was added during 20-32 days and 2 mg/L PCP was added during 33-75 days，the removal of influent COD and PCP was still poor.The adsorbed PCP in sludge causing the increase of sludge acute toxicity was only one of the reasons.The metabolic intermediates of PCP and secretive secondary metabolites by the enriched dominant microbes should not be ignored in the process of PCP degradation，which played an important role in causing the sludge acute toxicity.

0 引言

不同種類和性質的氯酚類化合物被廣泛應用于工業品的生產過程，如2，4-二氯苯酚（2，4-DCP）和2，4，5-三氯苯酚（2，4，5-TCP）大量用于農藥2，4-D和2，4，5-T的生產，五氯苯酚（PCP）用于血吸蟲病的防治等[1-2]，這導致大量的氯酚類化合物進入水體，對自然環境造成了很大的危害.此外，部分工業生產過程排放的廢水（如焦化廢水和造紙廢水）中也含有質量濃度較高的不同氯酚類化合物[3-4].由于氯酚類化合物會對生物的代謝造成不可逆的損害，甚至可能會引起致畸、致癌和致突變的“三致”效應，許多國家都將其列為重點管控的污染物[5-6].我國頒布的《生活飲用水衛生標準》（GB 5749—2006）也將2，4，6-三氯苯酚（2，4，6-TCP）、PCP等多種氯酚類化合物列為毒理檢測指標，要求對排放廢水中氯酚類化合物的質量濃度進行嚴格管控[7].

相關研究發現，采用物理和化學方法均可實現廢水中氯酚類化合物的去除，但廢水中的其他污染物（如懸浮物（SS）和氨氮）會影響其處理效果[8].此外，在污染物去除過程中，氯酚類化合物會產生多種中間產物，易對水體造成二次污染[9].因此，可考慮采用耐受污染物沖擊的活性污泥工藝.經氯酚類化合物馴化的活性污泥在降解去除氯酚類化合物的同時可去除其他類型的污染物，其菌群結構與不同反應器的運行條件有關[10]，如S.K.Karn等[11]研究發現，從造紙廠分離純化的菌株Pseudomonas stutzeri? CL7可礦化質量濃度高達600 mg/L的PCP.

然而，在利用活性污泥工藝處理廢水中氯酚類化合物的研究中，大部分研究者多關注水相和泥相中氯酚類化合物的去除效果、氯酚類化合物的降解動力學和降解路徑、降解氯酚類化合物的優勢菌群篩選等，而關于處理氯酚類化合物的污泥毒性相關問題的研究較少，也忽略了降解氯酚類化合物的優勢菌群對污泥毒性的影響.鑒于發光菌急性毒性生物實驗可有效評估廢水和污泥的急性毒性問題[12-13]，本研究在前期實驗的基礎上，擬利用耐受污染物沖擊和易于控制的序批式反應器（SBR）處理以甲醇為共代謝碳源的PCP廢水，控制其進水PCP質量濃度為10 mg/L，研究PCP對污泥急性毒性和菌群結構的影響，并分析優勢菌群對污泥急性毒性的作用，以期為準確評估處理工業廢水的污泥急性毒性和后續污泥資源化利用提供參考.

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

主要試劑：PCP（化學純，純度≥98.5%），上海飛祥化工廠產;無水甲醇（分析純），國藥集團化學試劑有限公司產;甲醇（色譜純，純度≥99.9%），北京百靈威科技有限公司產;超純水，英國ELGA超純水機（包含水柱）制取;明亮發光桿菌T3凍干粉，中科院南京土壤研究所產;AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒，美國Axygen公司產;pED-T載體試劑盒、Amp抗性LB培養基，上海凌科生物科技有限公司產;TAE緩沖液（1×），上海生工生物工程股份有限公司產;其他化學試劑均為分析純或優級純.

主要儀器：LC-20ATVP型高效液相色譜儀，日本島津公司產;DXY-2型生物毒性測定儀，中科院南京土壤研究所產;JJ-1型精密增力電動攪拌器，金壇市科技儀器有限公司產;GZX-9030 MBE型數顯鼓風干燥箱，博旭實業有限公司醫療設備廠產;TGL-18 M型臺式高速低溫離心機，上海安亭科學儀器廠產;FiveEasyTM型 pH計，上海梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產;YSI型便攜式DO計，上海維賽儀器貿易有限公司產.

1.2 實驗方案

接種污泥取自上海長橋污水處理廠的曝氣池，該污泥在投加到SBR前經3次清洗和24 h曝氣處理.實驗用SBR的有效容量為5 L，其高度和內徑分別為25 cm和20 cm.投加的初始污泥質量濃度（MLSS）和體積指數（SVI）分別為2.5 g/L和90 mL/g.單個SBR運行周期的水力停留時間（HRT）控制為12 h，具體為進水0.25 h，運行11 h，沉降0.5 h和排水0.25 h.調整SBR運行工藝為曝氣-靜置的循環模式，曝氣和靜置的時間均設置為2 h.為使溶解氧（DO）與活性污泥充分接觸，曝氣過程中對污泥進行攪拌，并控制DO質量濃度為（1.5±0.5） mg/L，靜置期間停止攪拌.SBR運行期間的溫度控制為（25±1） ℃，通過NaHCO3溶液和稀HCl調整進水的pH值為7.2±0.4.通過排泥的方式，整個運行過程中污泥的質量濃度控制在2.5 g/L左右.

實驗所用廢水為模擬廢水，由甲醇提供碳源，控制進水化學需氧量（COD）為（300±20） mg/L，N元素和P元素分別由尿素和KH2PO4提供，并補充微生物生長所需的大量元素和微量元素，具體成分及其質量濃度分別為：CO（NH2）2 32 mg/L、KH2PO4 13 mg/L、MgSO4·7H2O 23.9 mg/L、FeCl3·6H2O 7.0 mg/L、CaCl2·H2O 7.6 mg/L、CoSO4·7H2O 0.2 mg/L、ZnCl2 0.09 mg/L、MnSO4·H2O 0.06 mg/L、CuSO4·5H2O 0.047 mg/L和Na2MoO4·2H2O 0.05 mg/L.其中一個SBR進水中只補充甲醇，為對照組;另一個SBR進水中除補充一定量的甲醇外，再加入質量濃度為10 mg/L的 PCP，為實驗組，研究受PCP脅迫的污泥急性毒性和菌群結構，并分析優勢菌群對污泥急性毒性的作用.

1.3 指標測定及分析方法

利用pH計和DO計分別測定SBR運行過程中的pH值和DO值.按照文獻[14]中的酸性重鉻酸鉀法測定出水COD的質量濃度：取SBR運行結束后的水相，將其在 4000 r/min 條件下離心5 min后進行測定.采用重量法測定SBR運行期間的MLSS變化：取100 mL充分混勻的泥水混合液，經濾紙（已知質量）過濾后，在105 ℃條件下烘干、稱重.利用高效液相色譜儀測定污泥水相、泥相中殘留的PCP質量濃度：流動相為超純水（投加體積分數為1%的乙酸）和甲醇的混合液（二者體積比為2：8），柱溫為40 ℃，進樣體積為10 μL，流速為1 mL/min，測試波長為280 nm，固定相為反相C-18柱（250 nm×4.6 nm，5 μm）;水相經0.45 μm濾膜過濾后，直接測定其PCP的質量濃度，而泥相需先經超聲萃取后，再用濾膜過濾測定其PCP的質量濃度.

1.4 污泥急性毒性的測定方法

參考文獻[13]，采用發光菌急性毒性生物實驗方法測定污泥的急性毒性：實驗前用少量滅菌的質量分數為3%的NaCl溶液將明亮發光桿菌T3凍干粉復蘇，將復蘇的明亮發光桿菌接種到50 mL滅菌培養基（胰蛋白胨 5 g/L、酵母粉 5 g/L、丙三醇 3 g/L、NaCl 30 g/L、Na2HPO4 5 g/L和KH2PO4 1 g/L）中進行培養，當明亮發光桿菌處于指數生長期時進行污泥急性毒性的測定;為獲得準確的測定結果，需通過超聲方式對污泥絮體進行破碎處理;通過生物毒性儀測定明亮發光桿菌可見光強度的變化，利用相對抑光率表征污泥急性毒性的變化，每個樣品重復測試3次，取平均值.

1.5 菌群結構分析方法

利用成熟的溶菌酶-SDS-氯仿異戊醇技術對污泥中的基因組DNA進行提取，采用瓊脂糖凝膠電泳技術對提取的DNA進行檢測.采用的細菌16 S上游擴增引物序列為357FGC：5′CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG-CACGGGGGGGGCCTACGAGGCAGCAG3′;下游擴增引物序列為518r：5′ATTACCGCGGCTGCTGG3′.依據BioLinker公司的說明書分別進行第一輪和第二輪PCR擴增反應，其擴增產物通過40%～60%的變性梯度凝膠電泳（DGGE）進行分離，電泳參數設置為：電泳緩沖液為TAE緩沖液，電壓為80 V，水浴溫度為60 ℃，電泳時間為16.5 h，電泳結束后對凝膠進行染色、拍照，并在暗室紫外光激發條件下，用滅菌刀小心切割標記的優勢條帶.

切割條帶的第二次擴增所用引物與第一次相同，只是去掉GC發夾結構，采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產物，利用 pED-T 載體試劑盒克隆PCR產物.挑選克隆PCR產物，用Amp抗性LB培養基培養，待菌液培養至OD600值為2～3時，對菌液進行PCR擴增，將擴增產物送至上海鉑尚生物技術有限公司進行測序，做3次平行實驗以保證測序結果的準確度.

通過生物信息學軟件對有效的序列進行比對和篩選，去除T載體的引物;將全部序列結果整理為FASTA格式的序列文件，在NCBI中進行BLAST比對;將同一DGGE膠條中的3個克隆測序結果進行alignment分析，檢測條帶的一致性，并將比對結果中相似性最高的物種信息進行總結.

2 結果與討論

2.1 進水COD和PCP的去除效果

實驗期間，SBR出水COD、PCP質量濃度和MLSS的變化情況分別見圖1—圖3，其中10 mg/L、0 mg/L和2 mg/L指實驗組SBR不同運行階段的進水PCP質量濃度.實驗初期（第1—9 d），由于天氣變冷，SBR進水溫度逐漸降低，在第6 d時低至14.6 ℃，導致對照組出水COD質量濃度多次超過100 mg/L（見圖1）.考慮到微生物活性和污染物去除速率受溫度影響顯著[1]，故從第10 d開始，控制2個SBR運行溫度為（25±1） ℃，對照組出水COD質量濃度逐漸降低并趨于穩定.從第22 d開始到SBR運行結束，對照組出水COD質量濃度在（85.7±140） mg/L的范圍內波動，這是因為溫度升高會引起污泥中微生物活性的增強，而補充的甲醇屬于易降解碳源，導致SBR系統發生了內源呼吸，后續可考慮通過縮短HRT的方式改善進水COD的去除效果.

在第1—20 d期間，進水中的PCP質量濃度為10 mg/L，嚴重抑制了污泥活性，污泥絮體解體嚴重，導致上清液渾濁，出水COD質量濃度快速升高，第19 d時達到353.2 mg/L（見圖1），MLSS在第20 d時更是降至1.4 g/L（見圖3）.此階段的進水PCP基本無降解，水相和泥相中積累了大量的PCP（見圖2），這是因為PCP苯環上的π電子與Cl原子的p電子形成了穩定的共軛體系，同時Cl原子的存在抑制了苯環裂解酶的活性，使苯環上的電子云密度較低，再加上PCP的空間位阻效應，導致PCP難以被好氧微生物降解，故PCP廢水的處理多以厭氧工藝為主[15].

在第20—33 d期間，實驗組SBR進水中停止投加PCP，出水COD質量濃度緩慢下降，由第19 d 的353.2 mg/L降低至第33 d的 198.4 mg/L （見圖1），這是因為前期吸附至泥相中的PCP仍存在于SBR，并逐漸釋放到水相（見圖2）中，導致污泥活性恢復較慢.

在第33—75 d期間，調整實驗組SBR進水PCP質量濃度為2 mg/L，其出水COD質量濃度維持在200 mg/L附近;運行周期末（第60—70 d），水相和泥相中均能檢測到PCP，其殘留量分別為0.38 mg/L和0.81 mg/L，此時活性污泥降解PCP的速率較慢.這可能是由于前期進水中投加的PCP嚴重抑制了污泥活性，導致后期進水中無論是否投加PCP，污泥活性都難以恢復.在不排泥的情況下，實驗組SBR的MLSS一直低于2.0 g/L（見圖3），這也再次證實了PCP的毒性作用是導致污泥活性恢復緩慢的主要因素.在下一步的研究中，可利用離子色譜技術分析SBR系統中氯離子質量濃度的變化，采用氣質聯用或液質聯用技術定期分析PCP降解過程中產生的代謝中間產物，為準確推斷以甲醇為共代謝碳源的PCP降解路徑提供依據.另外，為避免氯酚類化合物對污泥活性的抑制作用，可考慮優先采用低質量濃度的氯酚進水馴化活性污泥，待污泥充分降解去除氯酚類化合物后再逐步提高進水氯酚的質量濃度.

2.2 PCP處理過程中污泥急性毒性的變化

對處理PCP的實驗組污泥急性毒性進行測定，與對照組作對比分析，其動態變化如圖4所示.對照組污泥的相對抑光率在25.8%附近波動，這可能是由污泥中微生物代謝過程產生的次級代謝產物和微生物的部分組成成分抑制了發光菌的活性而引起的.

然而，處理PCP的實驗組污泥急性毒性顯著高于對照組，且整體呈先升高后降低直至趨于穩定的變化規律，兩者差值較大的時間范圍為第6—41 d，其中最大的污泥急性毒性差值出現在第33 d，是對照組的1.84倍.然而，在此期間，污泥中吸附的PCP質量濃度變化很大（見圖2），這表明吸附至泥相的PCP僅僅是引起污泥急性毒性顯著的原因之一.在第49—70 d期間，實驗組污泥的相對抑光率在35.1%附近波動，是對照組的1.36倍.因此，實驗組污泥急性毒性的形成還應包括以下3個方面：一是活性污泥受PCP誘導產生大量的次級代謝產物，其中部分代謝產物會導致污泥急性毒性的增加[16];二是PCP降解過程中產生的不同類型代謝中間產物，會導致污泥急性毒性的增加，如G.Ruckdeschel等[17]研究發現，PCP及其中間產物對多種微生物均有毒性作用，且某些中間產物的毒性比母體要高出許多;三是許多微生物內源呼吸和解體產生的部分殘留物被吸附到泥相中，同樣具有一定的微生物毒性[18].因此，PCP處理過程中污泥急性毒性的變化是多種因素綜合作用的結果.

2.3 菌群結構對污泥急性毒性的影響

當處理PCP廢水的SBR運行70 d后，通過PCR-DGGE技術分析污泥中的菌群結構，并對優勢條帶進行鑒定，結果見圖5（圖中不同數字代表鑒定出的不同優勢菌群）和表1.部分優勢條帶的3個平行樣并不代表單一菌種（條帶1和3），這可能是由于鑒定的目的條帶附近含有相鄰的低亮度條帶或者不同菌屬的DNA條帶出現了共遷移現象[19].活性污泥中耐受PCP毒性的優勢菌屬大都出自變形菌門（Proteobacteria）（條帶1、2、4、5和6），主要菌屬為Methylobacillus、Pseudomonas、Porphyrobacter、Achromobacter、Stenotrophomonas和Comamonas，其次為綠彎菌門（Chloroflexi）（條帶3）和厚壁菌門（Firmicutes）（條帶7），其菌屬分別為 Levilinea和Salimesophilobacter.然而，對照組鑒定的優勢菌屬主要為Chryseobacterium、Leadbetterella、Erysipelothrix、Pontibacillus、Bosea和Salimesophilobacter[20]，這表明污泥的菌群結構受進水PCP的影響較大.相關研究已證實由實驗組污泥鑒定的大多優勢菌屬均具有降解去除氯酚類化合物和多環芳烴的功能，如Pseudomonas entomophila、Achromobacter marplatensis、Stenotrophomonas maltophilia和Comamonas testosterone[21].

受污染物脅迫，Methylobacillus arboreus、Pseudomonas entomophila、Comamonas testosteroni和Stenotrophomonas maltophilia可分泌多種次級代謝產物，其中抗生素和不同種類的生物活性因子可能會起到增加污泥急性毒性的作用，而其他次級代謝產物，如表面活性劑和谷胱甘肽轉移酶，可降低氯酚類化合物對微生物的毒害作用[22-25];Achromobacter marplatensis能夠降解高質量濃度的PCP，并具有抗生素活性[26];Porphyrobacter colymbi和Levilinea saccharolytica是否具有降解氯酚類化合物的功能，以及是否對污泥急性毒性有影響需進一步確定.相關分析表明，降解PCP的優勢菌群在代謝過程產生的次級代謝產物是引起污泥急性毒性不可忽視的重要因素[20].

3 結論

本研究利用間歇曝氣的SBR處理PCP廢水，設置僅以甲醇為碳源的對照組，研究PCP對污泥急性毒性和菌群結構的影響，并深入分析了優勢菌群對污泥急性毒性的作用.得到以下主要結論：1）進水中的PCP（質量濃度為10 mg/L）嚴重抑制了污泥活性，污泥絮體解體現象嚴重，進水COD和PCP難以被降解去除，即使后期進水PCP質量濃度降低或不再投加，污泥活性仍舊難以恢復;2）進水中的PCP導致污泥急性毒性顯著增加，而污泥急性毒性的升高不僅是由吸附至污泥的PCP引起，PCP降解過程產生的代謝中間產物及誘導微生物分泌的次級代謝產物也是引起污泥急性毒性的重要因素;3）經PCP馴化的活性污泥中富集的優勢菌屬具有降解去除氯酚污染物的能力，優勢菌種代謝過程分泌的次級代謝產物可影響污泥的急性毒性.依據本文研究結果，在利用活性污泥工藝處理工業廢水時，剩余污泥的急性毒性是不可忽略的問題.后續可通過選取合適的廢水處理工藝或調整其運行參數等措施削減污泥的急性毒性作用.參考文獻：

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收稿日期：2020-04-17

基金項目：國家自然科學基金項目（41801086）; 鄭州輕工業大學博士啟動基金項目（2016BSJJ036）

作者簡介：趙建國（1987—），男，山東省濰坊市人，鄭州輕工業大學講師，博士，主要研究方向為工業廢水處理及生態風險評估.