短期饑餓對雜交石斑魚(Epinephelus fuscogutatus♀×E. polyphekadion♂)幼魚消化酶活性與血清生化指標的影響

鄧文鑫 張健東 黃建盛 王忠良 潘傳豪 施鋼 湯保貴 陳剛

摘 要：為了解短期饑餓對雜交石斑魚 （Epinephelus fuscogutatus♀×E. polyphhekadion♂） 幼魚消化酶活性和血清生理生化指標的影響，對雜交石斑魚幼魚進行短期饑餓處理（0 d、5 d、10 d、15 d），分別為S0組、S1組、S2組和S3組，并以S0組為對照組。結果表明，隨著饑餓時間的延長，各種消化酶活性呈下降趨勢，淀粉酶活性呈先上升后下降趨勢。血清碳水化合物、膽固醇、甘油三酯、總蛋白、白蛋白等生化指標在饑餓前期顯著降低（P< 0.05），隨后維持在相對穩定的水平。AST、ALT、ALP活性呈“下降-上升-下降”趨勢。分析表明，在短期饑餓過程中，雜交石斑魚幼魚早期主要消耗碳水化合物和脂肪物質，后期主要以蛋白質代謝能量來維持生命活動，短期饑餓并沒有對雜交石斑魚造成不可逆轉的肝臟損傷。

關鍵詞：雜交石斑魚（Epinephelus fuscogutatus♀×E. polyphhekadion♂）;饑餓;消化酶活性;血清生理生化指標

自然環境下，由于季節更迭、環境變化或者是食物散布不均勻等影響，魚類在實際成長中存在顯著的食物缺口，進而導致饑餓的困境[1]。人工養殖的場景之中，魚類也會因餌料不足、養殖密度過大等問題導致饑餓[2]。饑餓脅迫下，魚類會依靠調控機體之中的酶活性、生化代謝等多種模式，降低耗能從而維持生命活動[3]。消化酶活性影響魚類最終的消化與吸收效果，進一步決定魚類的發育狀況，因此關于消化酶活性的相關研究一直是魚類消化生理的重要研究內容[4]。而研究魚類的血液生理生化指標可直接反映魚類健康狀態、生理和營養狀況[5]。

石斑魚（Epinephelus spp.）隸屬鱸形目（Perciformes），鱸亞目（Percoidei），鮨科（Serranidae），石斑魚亞科（Epinephelinae）。其味道鮮美，營養豐富，為我國沿海地區廣泛養殖魚種[6]。本試驗魚為雜交石斑魚，是褐點石斑魚（E.fuscogutatus♀）和清水石斑魚（E.polyphekadion♂）雜交子代，目前對雜交石斑魚的研究較少，研究的內容包括鹽度對受精卵孵化和卵黃囊仔魚形態及活性的影響[7];子代幼魚形態性狀對體質量影響的通徑分析[8];干擾素調節因子3（IRF3）基因的克隆及表達分析[9];生長激素、生長激素受體及雌激素受體的分子識別、生物信息學和表達譜分析[10]等。短期饑餓對雜交石斑魚幼魚消化酶活性的影響的研究尚未有學者涉足，所以論文計劃分析該場景中的消化酶活性以及血液生化指標的具體變動規律，同時初步研究饑餓場景中的魚體代謝指標、能源運用的次序與營養狀態，為雜交石斑魚養殖生產提供科學且有價值的參考資料。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用魚為取自廣東海洋大學湛江海洋高新科技園養殖所培育的褐點石斑魚（♀）×清水石斑魚（♂）雜交子一代幼魚，運回實驗室后在50 cm×70 cm×60 cm的養殖桶內暫養一周。暫養期間，養殖用水為經24 h曝氣的自然海區海水，鹽度（27±1.0）‰，水溫（28±1.0） ℃，溶氧質量濃度保持在6 mg/L以上，自然光照。每日于8：00、12：00、18：00三個時間點投喂配合飼料（“粵海牌”石斑魚配合飼料4#，顆粒直徑5 mm），每次達到飽食，投喂半個小時后通過虹吸清理殘餌和糞便，每天換水1～2次，每次1/3～1/2，換水溫差不超過1 ℃，保持水質清新。

1.2 試驗設計

暫養結束后，選用200尾體表無傷、體格健壯、體長為（12.42±0.93） cm、體重為（52.23±11.17）g的雜交石斑魚幼魚，進行短期饑餓處理（0、5、10、15 d），分別為S0組、S1組、S2組和S3組，并以S0組為對照組，各個組別設置3個平行，單個平行涉及15尾幼魚，實際數量為180尾。同時選擇20尾魚作為相應的連續饑餓備用。

1.3 樣品的制備及測定

1.3.1 血樣制備及測定 各個試驗組別饑餓完成的情況下，針對多個組別各個平行，運用隨機的方式選擇5尾魚，取樣操作之前用 MS-222 進行麻醉操作。用 2.5 mL 注射器取用相應的血液1～2 mL，放入到離心管內在4 ℃環境下存儲12 h，后續再置于4 000 r/min離心處理 10 min，取相應的上層血清運用深圳雷杜生命科技Chemray 800分析儀開展后續的指標測試。

1.3.2 酶液的制備及測定

針對麻醉取血處理之后的幼魚，迅速解剖剝離獲取腸胃及肝臟，剔除內容物及腸系膜后，用預冷的生理鹽水沖凈，迅速放入液氮中冷藏，待所有魚取樣完成后，按編號轉入冰箱（-80 ℃）儲存備用。從冰箱中取出待測樣品，4 ℃下解凍，用剪刀剪成小塊，加入10倍體積預冷生理鹽水，在高速組織勻漿機中冰浴勻漿，勻漿液經2 500 r/ min的速率離心10 min后取上清液，并置于4 ℃冰箱中保存，進行酶活性檢測。用試劑盒測試肝、腸、胃3 類組織的三類酶活性指標，并且用考馬斯亮藍染色法來確認其中具體的蛋白濃度指標。

蛋白酶活性：37 ℃狀態下，實際取用的每mg組織蛋白，持續1 min分解獲得相應的1 mg氨基酸，代表其擁有1個酶活單位（U）;淀粉酶活性：37 ℃狀態下，實際取用的每mg組織蛋白和底物之間產生作用30 min水解10 mg淀粉，代表其擁有1個酶活單位（U）;脂肪酶活性：37 ℃狀態下，實際取用的每mg組織蛋白在該反應系統之中和底物之間反應1 min，每消耗相應的1 μmol底物，代表其擁有1個酶活單位（U）。酶活性運用相應的比活性（每mg蛋白活性單位，U·mg-1）的方式進行表述。

1.4 數據處理

用SPSS19.0軟件進行生物統計分析，采用單因素方差分析和Duncan檢驗法進行多重比較。結果用“平均值±標準差（Meant±SD） ”表示，P<0.01表示具有極顯著性差異，P<0.05 表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 短期饑餓對雜交石斑魚幼魚消化酶活性的影響

測定結果見圖1。各饑餓組蛋白酶活性和脂肪酶活性變化明顯，均隨饑餓時間的延長持續降低，饑餓處理S0組的腸、肝、胃的蛋白酶活性均高于其它各組（P<0.05），肝臟中的蛋白酶變化最小。脂肪酶活性饑餓前期下降幅度顯著（P<005），后期降幅緩慢（P<0.05）。腸、肝、胃三個組織的淀粉酶活性較低，整體隨饑餓時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，腸淀粉酶活性S1組顯著高于其它各組（P<0.05）。

2.2 短期饑餓對雜交石斑魚幼魚能量代謝指標的影響

各饑餓組對雜交石斑魚幼魚能量代謝測定結果見圖2。糖類物質代謝總體隨饑餓時間的延長而持續下降，之后維持在相對穩定的水平。雜交石斑魚的血糖對饑餓比較敏感，饑餓5 d后，血糖含量顯著降低（P<0.05）。隨饑餓時間的延長，血糖一直處于顯著低于對照組的水平（P<005）;肝糖原含量S2與S3組差異不顯著（P>0.05）;肌糖原含量S1與S2組差異不顯著（P>0.05）。

2.3 短期饑餓對雜交石斑魚幼魚肝功能指標的影響

在饑餓脅迫下，雜交石斑魚幼魚肝功能指標的變化情況見圖3。堿性磷酸酶（ALP）和谷丙轉氨酶（ALT）活性隨饑餓時間延長呈現先降低再升高后下降的趨勢;谷草轉氨酶（AST）則隨饑餓時間延長而持續下降（P<0.05），S1組與S2組差異不顯著（P>0.05）。

2.4 短期饑餓對雜交石斑魚幼魚血清脂代謝和蛋白質代謝指標的影響

饑餓脅迫對雜交石斑魚幼魚血清生化指標的變化情況見圖4。膽固醇和白蛋白隨饑餓時間延長而不斷下降，S1與S2組間差異不明顯（P>005）;總蛋白和甘油三酯隨饑餓時間延長下降幅度顯著（P<0.05），呈現階梯性下降。

3 討論

3.1 短期饑餓對雜交石斑魚幼魚消化酶活性的變化分析

饑餓脅迫下的魚類，依靠調控消化酶活性的方式來調動身體中的營養，進而適應環境的改變和維持機體的正常生理活動[1]。因此，消化酶活性的變化在一定程度上反應魚類生長與環境條件之間的關聯[11]。本試驗中，雜交石斑魚幼魚的肝、腸和胃中3種消化酶（蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶）活性均隨饑餓時間的延長而逐漸下降，此結果與千年笛鯛幼魚（Lutjanus sebae）[12]饑餓實驗結果相一致。原因是在饑餓脅迫下，雜交石斑魚幼魚為了維持生命所需的各種基本生理需要，從而降低能量損耗。而淀粉酶整體呈現先上升后下降的趨勢，分析可能為雜交石斑魚幼魚受到饑餓的脅迫，為了更好地吸收體內殘留的淀粉和糖原而導致淀粉酶活性上升。蛋白酶活性變化明顯，腸、肝、胃三個組織的蛋白酶活性對照組（饑餓處理0 d）始終高于其它各組，總體呈現下降的趨勢。這與錢云霞13]的研究結果一致，與蘇慧等[2]研究結果相反，這說明饑餓對不同魚類蛋白酶活性的影響也不同。本試驗中胃蛋白酶活性顯著高于腸和肝，肝蛋白酶活性最低; Das等[14]看來肝胰腺重點分泌蛋白酶原，所以活性相對較低乃至于不存在活性。本研究結果與此相符合，雜交石斑魚蛋白酶活性胃最高，腸次之，肝臟最低，這說明可能胃是雜交石斑魚幼魚蛋白酶消化的主要部位。饑餓前期，脂肪酶活性下降顯著;饑餓10 d后，雜交石斑魚腸、肝、胃三個組織的脂肪酶活性基本趨于平緩，試驗結果與Furné[15]和張怡波等[16]相一致，分析可能是雜交石斑魚幼魚為了適應饑餓脅迫以及配合其它種類的消化酶，對脂肪酶活性作出了調整，以便長時間適應饑餓脅迫環境并生存下去。

魚類在受到饑餓脅迫時，由于只能利用消耗體內的殘留物質和自身能源物質，為了適應饑餓環境，繼續生存，需要通過調節自身各種消化酶活性來消耗體內貯藏的營養物質，以維持生命。本試驗中，消化酶活性呈總體下降狀態，分析原因有三種，一是在饑餓脅迫環境下，魚類的消化系統沒有接收到食物的機械刺激信號，所以消化酶的分泌會減少[1];二是饑餓脅迫下的魚類，因沒有受到視覺、嗅覺、味覺等感覺的刺激，中樞神經系統不分泌激素促使消化腺分泌[17];三是饑餓脅迫損傷了魚類消化道組織結構，致使組織結構萎縮，消化功能衰退[18-19]。

3.2 短期饑餓對雜交石斑魚幼魚血清生理生化的變化分析

魚類生化指標可判斷適應狀況與營養信息[20]。恒定的血糖濃度對維持魚類正常生命活動有重要的作用。饑餓 5 d后血糖大幅降低，后續保持相對平穩的狀態，和刀鱭（Coilia nasus）[21]的數據基本相同，主要原因為魚體中有保持血糖固定的調節體系。在遭遇饑餓的情況下，魚類無法通過食物獲得相關碳水、脂質等營養，因此血糖重點依靠糖異生來維持穩定[22]。通常情況下，脂肪與糖原作為核心的儲能，禁食場景中重點耗費兩類物質[23]，魚體糖類運用糖原的模式位于肝臟與肌肉。魚的饑餓場景之中，并不存在外部供養，饑餓最開始階段耗費的能源源自糖原以及內臟周邊所存儲的脂肪[24]。

血清實際的甘油三酯以及總膽固醇指標，用于表述具體的利用脂質信息[25]。分析得出，短期饑餓脅迫下，雜交石斑魚幼魚血清總膽固醇和甘油三酯水平顯著下降。該結果表明，饑餓脅迫下雜交石斑魚可能持續利用體內存儲的脂肪為機體提供能量，隨饑餓時間延長，存儲脂肪含量下降，可利用的甘油三酯含量降低，雜交石斑魚難以通過脂肪代謝為機體提供充足能量。

魚體中血液蛋白含量與新陳代謝、能量消耗以及免疫強弱有關。當受到外界脅迫時新陳代謝加強，能量消耗加快，導致血液中的蛋白含量下降，免疫能力也隨之下降[26]。饑餓5 d，雜交石斑魚幼魚血清白蛋白下降顯著，之后緩慢下降，組間差異不顯著。白蛋白含量的減少可能會導致整體免疫水平的下降，總蛋白含量的相對穩定是魚體自身調節的表現，也與實驗有關，因為除饑餓外并無其它脅迫，魚體不需要維持高的代謝和能量消耗[27-28]。

血清中 AST、ALT 和 ALP 的活性一般被用作判斷肝功能是否正常的指標[29]，當組織發生損傷或病變時，特別是肝損傷，其活性會迅速升高。相關分析得出血清轉氨酶活性下降與維生素B6不足存在密切聯系，堿性磷酸酶的下降和鋅缺乏存在密切聯系[30]。關于魚類饑餓的分析得出，饑餓造成哲羅魚[31]和南方鲇[32]的這三種酶活顯著降低，與本試驗的研究結果一致，表明短期饑餓脅迫尚未造成雜交石斑魚肝損傷。亦有和試驗結果有所區別的分析，類似于饑餓對鮭魚血漿AST指標并未產生影響[33];饑餓對鲇血清ALP指標并沒有產生影響[34]，代表多種魚類所遭遇的影響有區別，原因或許是不同種類的魚類實際蓄積的營養與承受饑餓的能力有所區別。

參考文獻：

[1]

謝小軍，鄧利，張波.饑餓對魚類生理生態學影響的研究進展[J].水生生物學報，1998（2）：181-188.

[2] 蘇慧，區又君，李加兒，等.卵形鯧鲹消化酶活力的研究Ⅵ饑餓對幼魚存活和消化酶活力的影響[J].海洋漁業，2012，34（1）：45-50.

[3] MCCUE M D.Starvation physiology：Reviewing the different strategies animals use to survive a common challenge[J].Comparative Biochemistry & Physiology Part A Molecular & Integrative Physiology，2010，156（1）：1-18.

[4] 江麗華，朱愛意，苑淑賓.饑餓對褐菖鲉消化道指數及消化酶活力的影響[J].水產科學，2011，30（4）：187-191.

[5] 林浩然.魚類生理學[M].廣州：廣東高等教育出版社，1999：185-188.

[6] 孫穎.棕點石斑魚（♀）×鞍帶石斑魚（♂）雜交F1代生長優勢的轉錄組學研究[D].廣州：中山大學，2016.

[7] 黃建盛，陳剛，張健東，等.鹽度對雜交石斑魚受精卵孵化和卵黃囊仔魚形態及活力的影響[J].中國水產科學，2017，24（3）：507-515.

[8] 黃建盛，張敬威，陳剛，等.褐點石斑魚（♀）×清水石斑魚（♂）雜交子代幼魚形態性狀對體質量影響的通徑分析[J].廣東海洋大學學報，2017，37（3）：23-28.

[9] 盧曉穎，黃寶松，馬騫，等.雜交石斑魚干擾素調節因子3（IRF3）基因的克隆及表達分析[J].生物技術通報，2019，35（10）：144-151.

[10] AMENYOGBE E.雜交石斑魚（褐點石斑魚♀×清水石斑魚♂）生長激素、生長激素受體及雌激素受體的分子識別、生物信息學和表達譜分析[D].湛江：廣東海洋大學，2019.

[11] PEDRO N D，DELGADO M J，GANCEDO B，et al.Changes in glucose，glycogen，thyroid activity and hypothalamic cate-chola mines in tench by starvation and refeeding [J].Journal of Comparative Physiology B：Biochemical，Systemic，and Environmental Physiology，2003，173（6）：475—481.

[12] 區又君，劉澤偉.饑餓和再投喂對千年笛鯛幼魚消化酶活性的影響[J].海洋學報（中文版），2007（1）：86-91.

[13] 錢云霞.饑餓對養殖鱸蛋白酶活力的影響[J].水產科學，2002，（3）：6-7.

[14] DAS K M，TRIPATHI S D.Studies on the digestive enzymes of grass carp，Ctenopharyngodon idella（Val.）[J].Aquaculture，1991，92（1）：21-32.

[15] FURN M，GARGA-GALLEGO M，HIDALO M C，et al.Effect of starvation and refeeding ondigestive enzyme activities in sturgeon（Acipenser naccarii）and trout（Oncorhynchusmykiss）[J].Comparative Biochemistry and Physiology，2008，149（4）：420-425.

[16] 張怡波，呂慧明，袁子，等.饑餓再投喂對黑鱾幼魚消化酶活性與血液生理生化指標的影響[J].寧波大學學報（理工版），2019，32（5）：12-16.

[17] 錢國英.不同馴食方式對鱖魚胃腸道消化酶活性的影響[J].浙江農業大學學報，1998（2）：99-102.

[18] EHRLICH K F，BLAXTER J H S，PEMBERTON R.Morphological and histological changes during the growth and starvation of herring and plaice larvae[J].Marine Biology，1976，35（2）：105-118.

[19] SUN S M， SU Y L， YU H，et al.Starvation affects the intestinal microbiota structure and the expression of inflammatory-related genes of the juvenile blunt snout bream，Megalobrama amblycephala[J].Aquaclture，2020，517：734764.

[20] 胡麟，吳天星.饑餓對魚類生理生化的影響[J].水利漁業，2007，27（1）：7-9.

[21] 金鑫，徐鋼春，杜富寬，等.饑餓脅迫對刀鱭形體、體成分及血液生化指標的影響[J].動物學雜志，2014，49（6）：897-903.

[22] GILLIS T E，BALLANTYNE J S.The effects of starvation onplasma free a mino acid and glucose concentrations in lake sturgeon[J].Journal of Fish Biology，1996，49（6）：1306-1316.

[23] 杜震宇，劉永堅，田麗霞，等.饑餓對于鱸肌肉、肝臟和血清主要生化組成的影響[J].動物學報，2003，49（4）：458-465.

[24] 程超，施光美.饑餓對鯽魚血液生理生化指標和流變學性質的影響[J].中國農學通報，2008，24（1）：516—519.

[25] 孫紅梅.饑餓對黃顙魚血液指標及免疫機能的影響[D].長春：吉林農業大學，2004.

[26] 封功能，楊文平，王愛民，等.饑餓脅迫對鯉形體、體成分及血液生理指標的影響[J].上海海洋大學學報，2011，20（6）：814-819.

[27] 許源劍，孫敏.環境脅迫對魚類血液影響的研究進展[J].水產科技，2010（3）：27-31.

[28] 桂遠明，吳垠，祝國芹，等.幾種養殖魚類越冬生理生化指標的變化Ⅰ─—血液指標及代謝率[J].大連水產學院學報，1994（3）：15-27.

[29] GHOLIZDEH Z T B，BANAEE M，JOURDEHI Y A，et al.Effects of selenium （Sel-Plex） supplement on blood biochemical parameters of juvenile Siberian sturgeon （Acipenser baerii） [J].Iranian Journal of Fisheries Sciences.2018，17（2）：300-312.

[30] WANER T，NYSKA A.The toxicological significance of decreased activities of blood alanine and aspartate a minotransferase [J].Veterinary Research Communications，1991，15（1）：73-78.

[31] 楊成輝，蔡勛，劉霞，等.饑餓和再投喂對哲羅魚幼魚血液生理生化指標的影響[J].淡水漁業，2009，39（1）：36-40.

[32] 陳曉耘.饑餓對南方鯰幼魚血液的影響[J].西南農業大學學報，2000，22（2）：167-169.

[33] 羅波，馮健，蔣步國，等.饑餓對太平洋鮭生長、機體組成及血漿相關生化指標變化研究[J].水生生物學報，2010，34（3）：541-546.

[34] 喬志剛，張建平，牛景彥，等.饑餓和再投喂對鲇血液生理生化指標的影響[J].水生生物學報，2008，32（5）：631-635.

Effects of short-term starvation on digestive enzyme activities and serum biochemical indexes of juvenile hybrid grouper （Epinephelus fuscogutatus♀×E. polyphekadion♂）

DENG Wenxin1， ZHANG Jiandong1，2，3， HUANG Jiansheng1，2，3， WANG Zhongliang1，2，3，PAN Chuanhao1， SHI Gang1， TANG Baogui1，2，3， CHEN Gang1，2，3

（1.Fishery College， Guangdong Ocean University， Zhanjiang 524088， China; 2.Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory （Zhanjiang）， Zhanjiang 524025， China;3. Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals， Zhanjiang 524088， China）

Abstract：This experiment was conducted to study the effects of short-term starvation on digestive enzyme activities and serum physiological and biochemical indices of juvenile hybrid grouper （Epinephelus fuscogutatus♀×E. polyphekadion♂）.Juvenile hybrid groupers were starved for a short time （0d，5d，10d，and 15d），the fish were grouped into two namely，control and experimental groups，with replicates of 3 per group and 15 fish per replicate （S0 as control，S1，S2 and S3 as experimental groups respectively）.The digestive enzyme activities and serum indices of juvenile hybrid groupers were determined using S0 group as a control group.The results showed that digestive enzyme activities decreased with the prolonging of starvation time，and the activities of amylase increased first and then decreased.Serum carbohydrate，cholesterol，triglyceride，total protein，albumin，and other biochemical indices were significantly decreased in the early starvation period （P<0.05） and then maintained at a relatively stable level.AST，ALT，and ALP activities showed a serrated step decrease.According to the analysis，in the process of short-term starvation，juvenile hybrid grouper mainly consumed carbohydrate and fatty substances in the early stage and metabolized energy based on protein in the later stage to maintain life activities，and short-term starvation did not cause irreversible liver damage to hybrid grouper.

Key words：hybrid grouper;starvation;digestive enzyme activites;serum biochemical indices

（收稿日期：2021-01-26）