天津地區南美白對蝦弧菌病主要病原菌耐藥性調查

徐赟霞 楊凱 王禹 馮守明

摘 要：采用K-B紙片擴散法和微量稀釋法對從天津地區養殖的南美白對蝦（Penaeus vannamei）中分離的弧菌進行耐藥性調查，結果顯示2020年在養殖季節從天津市患病的南美白對蝦中共分離出弧菌33株，其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、創傷弧菌7株、霍亂弧菌3株。在天津市南美白對蝦以副溶血弧菌污染最為嚴重，約占總數的45%左右。藥敏結果顯示分離的33株弧菌對2種及2種以上藥物耐藥的有27株，約占總數的81.8%，說明天津地區弧菌已經出現了多重耐藥的現象;通過對33株弧菌對藥物的MIC值測定，33株弧菌對恩諾沙星、氟甲喹和鹽酸多西環素比較敏感，對磺胺類藥物比較耐藥。結果提示應加強對天津地區南美白對蝦弧菌病主要病原菌耐藥性監控。

關鍵詞：南美白對蝦（Penaeus vannamei）;弧菌;耐藥性

南美白對蝦（Penaeus vannamei），又稱凡納濱對蝦 、白腳蝦，原產于中、南美洲太平洋沿岸水域，是目前世界上養殖產量較高的品種之一[1]。南美白對蝦作為優質水產養殖品種，因其營養豐富、味道鮮美，深受天津市市民的喜愛，同時也為廣大養殖戶帶來了可觀的經濟效益。隨著對蝦養殖規模的不斷擴大，集約化程度的不斷提高，受外界的因素和人為的影響，南美白對蝦養殖病害頻繁發生，給養殖戶帶來嚴重的經濟損失[2]。弧菌是一種條件致病菌，當養殖水環境惡化或者其他因素影響，會使對蝦體內機能平衡關系被打破，原來不致病的正常菌群中的細菌可成為致病菌。南美白對蝦細菌病的主要原因是弧菌病[1]，能夠引起蝦類等大量死亡。

在天津市發生上述疾病時常以藥物防控為主，主要應用抗菌藥物進行滅菌，藥物治療成為防治養殖水生動物細菌性疾病的重要手段。但由于天津市南美白對蝦養殖中以小戶、散戶居多，大部分養殖戶在病害的防治上多是猜測著用藥、試著用藥，目前隨著治療水產養殖中細菌病的抗菌素類藥物使用劑量的加大，使細菌產生了耐藥性。很多細菌從原來的單一耐藥發展為多重耐藥，且耐藥性還有擴大的趨勢，抗菌素類藥物殘留于水生動物食品中，給水產品質量安全帶來巨大威脅。為此，本研究主要對天津市南美白對蝦弧菌病主要病原菌的耐藥性進行調查，推進天津市對蝦養殖過程中抗菌藥物的精準使用、減量使用，遏制水生動物病原菌耐藥性的擴大趨勢，保障天津市水產品質量安全。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在養殖季節收集天津地區養殖的行動緩慢、生長遲緩、患紅體病等不健康的南美白對蝦作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離 在無菌條件下，用接種環蘸取南美白對蝦肝胰腺接種于TCBS選擇培養基上，劃線分離后將培養皿至于恒溫培養箱中，于28 ℃±1 ℃培養24 h后，挑取單菌落，劃線接種于營養瓊脂（NA）平板，純化后備用。

1.2.2 病原菌的生化鑒定 采用法國梅里埃公司生產的VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統對病原菌進行生化特征分析。

1.2.3 藥敏試驗

1.2.3.1 弧菌的藥物敏感性測定 采用K-B紙片擴散法，將培養24 h的新鮮菌落用0.85%的無菌生理鹽水洗下，制成1.5×108CFU/mL的菌懸液，用滅菌的棉球蘸取菌懸液后均勻涂布于MHA平板，待菌懸液被培養基吸收后，再用滅菌鑷子取藥敏紙片，分別貼于接種了細菌的MHA培養基表面，倒置放于28 ℃恒溫培養箱中培養24 h后，用直尺量取抑菌圈大小。結果判斷參照美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI）標準[3]。藥敏紙片購自Oxoid公司，在有效期內使用。抗菌藥物的藥敏紙片含量、藥敏實驗判定標準見表1。

1.2.3.2 病原菌最低抑菌濃度的測定 采用稀釋法測定抗菌藥物的最小抑菌濃度（MIC），采用藥敏板對病原菌進行恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環素、氟甲喹、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶等8種藥物MIC的測定，藥敏板購自南京菲恩醫療科技公司。使用ATCC25922大腸埃希氏菌作為質控菌株。

1.2.4 數據統計方法 使用SPSS軟件對MIC50、MIC90進行統計。

2 結果與分析

2.1 弧菌在天津市南美白對蝦中的分布情況

2020年在養殖季節從天津市不健康的南美白對蝦中共分離出弧菌33株，經生化鑒定，其中副溶血弧菌15株、溶藻弧菌8株、創傷弧菌7株、霍亂弧菌3株。在天津市南美白對蝦以副溶血弧菌污染最為嚴重，約占總數的45%左右。

2.2 病原菌藥物敏感性測定

對33株弧菌進行藥物敏感性測定，結果見表2，從表2中可以看出，33株弧菌對氟苯尼考、多西環素、恩諾沙星等比較敏感，對新霉素、阿莫西林等耐藥。其中只有1株（3.0%）弧菌對所有抗生素都敏感，對1種抗生素耐藥的有5株（152%），對2種抗生素耐藥的有12株（303%），對3種抗生素耐藥的有10株（363%），對4種抗生素耐藥的有5株（15.2%）。

2.3 病原菌最低抑菌濃度的測定結果

33株弧菌對8種抗菌藥物感受性測定結果見表3和圖1，從表3中可以看出33株弧菌對恩諾沙星、氟甲喹和鹽酸多西環素比較敏感，其MIC90分別為2.62 μg/mL、3.937 μg/mL和6548 μg/mL;其對磺胺類藥物比較耐藥，MIC90超過512 μg/mL;其對硫酸新霉素和甲砜霉素相對耐藥，MIC90分別為175.778 μg/mL和111.6 μg/mL。

3 討論

弧菌廣泛存在于自然界內，可以與養殖動物共存，不會引起疾病，但是當養殖南美白對蝦水環境惡化、受傷、體弱、抗病力降低等，弧菌會乘虛而入，便會引起南美白對蝦發生嚴重疾病，甚至死亡[4]。2020年在天津市寶坻區周邊養殖的患病南美白對蝦中共分離出弧菌33株，其中副溶血弧菌15株，約占總數的45%左右，說明在天津市南美白對蝦細菌病中以副溶血弧菌污染最為嚴重，這與江艷華[5]等報道相一致，尤其在夏秋季節容易暴發流行。

當前天津市南美白對蝦養殖發生細菌性疾病時，藥物防治仍然是主要的治療手段。為了防治疾病，不少養殖戶在飼料中長期添加抗菌藥物。在發生疾病的時候，養殖戶盲目亂用、濫用抗菌藥物，造成了細菌耐藥性的產生，而且耐藥程度不斷提高，甚至出現了多重耐藥現象，危害嚴重。本研究考察了從天津市患病的南美白對蝦分離出的弧菌對常用的八類抗生素的耐受情況，結果顯示，分離的33株弧菌對2種及2種以上藥物耐藥的有27株，約占總數的81.8%，說明天津地區弧菌已經出現了多重耐藥的現象;在此基礎之上我們又測定了33株弧菌對8種藥物的MIC值，33株弧菌對恩諾沙星、氟甲喹和鹽酸多西環素比較敏感，其MIC90分別為2.62 μg/mL、3.937 μg/mL和6.548 μg/mL;對磺胺類藥物比較耐藥MIC90超過512 μg/mL。本試驗結果可為天津地區養殖南美白對蝦過程中出現的弧菌病用藥提供理論支撐。

綜上所述，在天津地區養殖南美白對蝦過程中由于抗菌藥物的不合理使用，已使大量弧菌產生了耐藥性，而且已經出現了多重耐藥的現象。細菌耐藥性的產生多是由于抗生素選擇的結果，在水產養殖過程中，細菌的耐藥性可通過耐藥質粒的轉移將耐藥性進行傳遞，而水產養殖又具有擴散性和流動性等特點，因此水產動物細菌將耐藥性傳播給人類致病菌潛在危險極大[6]。為了降低南美白對蝦弧菌耐藥性，可以采取以下幾種方式：在飼料中添加免疫制劑，提高對蝦抗病力，減少疾病的發生[7];在治療疾病時，從患病動物體內分離病原菌進行藥敏試驗，根據藥敏試驗結果選藥，不可盲目選擇抗菌藥物;定期對養殖南美白對蝦體內攜帶的致病菌進行耐藥性監測，掌握養殖水體和南美白對蝦體內致病菌對各種抗菌藥物的耐藥性變化[8];應積極開展水產動物源細菌耐藥性監測和研究。

參考文獻：

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The antimicrobial resistance investigation of Vibrio from Penaeus vannamei in Tianjin area

XU Yunxia， YANG Kai， WANG Yu， FENG Shouming

（Tian Jin Animal Disease Prevention and Control Center，Tianjin 300402，China）

Abstract：The antimicrobial resistance investigation of Vibrio was performed by K-B and Microdilution method which isolated from Penaeus vannamei cultured in Tianjin area.The results showed that 33 strains of Vibrio were isolated from the diseased Penaeus vannamei in the breeding season in 2020， including 15 strains of Vibrio parahaemolyticus， 8 strains of Vibrio alginolyticus， 7 strains of Vibrio vulnificus and 3 strains of Vibrio cholerae.Vibrio parahaemolyticus was the most of them， accounting for about 45% of the total.The drug sensitivity results showed that 27 of the 33 Vibrio strains isolated were resistant to 2 or more kinds of antibiotics， accounting for 81.8% of the total， indicating that multiple drug resistance had appeared in Tianjin.Mics showed that 33 Vibrio strains were more sensitive to enoxacin， flumequine and doxycycline hydrochloride， and more resistant to sulfonamides.The results suggested that it is necessary to strengthen the monitoring of pathogenicity and antimicrobial resistance of Vibriosis which isolated from Penaeus vannamei cultured in Tianjin.

Key words：Penaeus vannamei; Vibrio;antimicrobial resistance

（收稿日期：2020-12-21;修回日期：2021-01-07）