紅托竹蓀腐爛病發(fā)病部位侵染真菌的研究*

李建英，吳素蕊，劉春麗，尚陸娥，羅孝坤，劉紹雄**

（1.云南省供銷合作社科學(xué)研究所，云南 昆明 650221；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650221）

紅托竹蓀（Dictyophora rubrovolvata M.Zang，et al.）屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）蘑菇綱（Agaricomycetes）鬼筆目 （Phallales）鬼筆科 （Phallaceae）竹蓀屬（Dictyophora）[1]，其味道鮮美，口感脆嫩。紅托竹蓀含有豐富的氨基酸、無機鹽、維生素等生物活性物質(zhì)[2]，硒元素（Se）含量較高，遠超富硒的許多農(nóng)副產(chǎn)品[3-5]，且含有豐富的多糖，具有抗腫瘤、抗氧化等功效[6-10]，是珍稀的食（藥）用菌。紅托竹蓀在市場上認可度較高，具有極大的產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿Γ壳叭斯ぴ耘嗝娣e增長迅速，在貴州等地是重點發(fā)展的人工栽培食用菌品種。

隨著食用菌栽培產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，紅托竹蓀栽培中的問題日益凸顯，近年來比較嚴重的是紅托竹蓀菌蛋腐爛病害發(fā)生普遍。病害發(fā)生初期，菌蛋表面出現(xiàn)水漬狀液體，后表皮開始腐爛，感染多種真菌，導(dǎo)致大面積污染，造成畸形菇或者無法出菇，引起減產(chǎn)甚至絕收[11]。國內(nèi)許多對紅托竹蓀腐爛病的研究中發(fā)現(xiàn)，環(huán)境條件對腐爛病發(fā)生的影響很大，而沒有證據(jù)證明紅托竹蓀腐爛病是由微生物感染引起[12-14]。潘高潮等[15]的研究表明，高溫高濕是誘發(fā)菌蛋發(fā)病的關(guān)鍵，病因是菌蛋長時間處于高溫（35℃）條件下引起菌蛋表層的免疫力低下。盧穎穎等[16]的調(diào)查也證實，發(fā)生腐爛病的大棚溫度過高（32℃～36℃），未能及時降溫；且在研究中也發(fā)現(xiàn)，發(fā)生腐爛病但尚未感染真菌的水漬狀斑點表皮組織經(jīng)培養(yǎng)后與正常子實體菌絲形態(tài)無差別，說明病變組織未壞死。也就是說，若沒有真菌侵染發(fā)病部位，盡管發(fā)生了腐爛病害產(chǎn)生病斑，后期也不至于大范圍減產(chǎn)甚至絕收[16]。

上述研究表明，紅托竹蓀腐爛病的起因是高溫損傷后菌蛋免疫力低下，出現(xiàn)腐爛病斑塊，后期因真菌感染引起大范圍二次病害，影響出菇。由此可推測后期感染真菌導(dǎo)致二次病害是紅托竹蓀腐爛病危害的主要因素，菇農(nóng)在沒有明確病因的情況下亂用藥，不但沒有效果，而且會造成不必要的農(nóng)藥殘留。因此，只有明確后期感染的真菌，進行針對性處理，才能更有效地預(yù)防后期真菌感染引起二次病害，減少紅托竹蓀腐爛病發(fā)生后產(chǎn)生的經(jīng)濟損失。

通過采集紅托竹蓀腐爛病害樣本，對病害部位感染的真菌進行分離純化和鑒定，以期探明紅托竹蓀腐爛病后期引起二次病害的侵染真菌，為腐爛病后期二次病害的針對性防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集自貴州安龍縣紅托竹蓀栽培基地，感染腐爛病的紅托竹蓀病害菌蛋，見圖1。

圖1 感染腐爛病的紅托竹蓀菌蛋Fig.1 Rotten Dictyophora rubrovolvata infected with fungi

由圖1所示，采集地的紅托竹蓀菌蛋腐爛病較嚴重，部分菌蛋表面有水漬狀斑點，有的菌蛋上已產(chǎn)生不同大小的腐爛病病斑，且病斑上已見明顯的白色或灰綠色真菌菌落，真菌感染嚴重的菌蛋有不同程度的腐爛現(xiàn)象。根據(jù)栽培基地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，病害發(fā)生前由于天氣變化、通風(fēng)不暢等原因?qū)е麓笈餃囟扔谐^32℃的現(xiàn)象，持續(xù)時間達48 h，棚內(nèi)濕度較高；發(fā)病前大棚內(nèi)外蚊蟲較多，病害發(fā)生后菌蛋腐爛，蚊蟲增多。

1.2 腐爛病后期感染真菌菌株分離純化

在超凈工作臺中用酒精燈灼燒后的接種針挑取腐爛病發(fā)病部位感染的真菌菌絲至PDA培養(yǎng)基中，24℃培養(yǎng)3 d～5 d，觀察菌落生長情況。培養(yǎng)至菌落直徑2 cm左右時，挑取菌落邊緣部位進行純化，直至獲得純菌株菌落。

1.3 菌株分子鑒定

后期感染真菌菌株分子鑒定采用ITS序列分析法，送至昆明碩擎生物科技有限公司進行測序。序列經(jīng)過雙向校準后在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，下載相似度較高（99%以上）且已發(fā)表的序列，以米根霉（Rhizopus oryzae）ITS序列作為外類群，用 MEGA 6.0軟件構(gòu)建 Neighbor-joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹，明確紅托竹蓀腐爛病后期感染真菌的分類學(xué)地位。

2 結(jié)果與分析

通過對紅托竹蓀腐爛病發(fā)病部位后期侵染真菌的分離純化，共得到12個純菌株，通過ITS序列測定，比對結(jié)果見表1，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。

表1 紅托竹蓀腐爛病后期侵染真菌序列比對結(jié)果Tab.1 Sequence determination results of fungal infection on the rotten Dictyophora rubrovolvata

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由表1和圖2可知，分離得到的菌株序列與參考序列相似度均達到99%以上，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析，12個菌株中有11個菌株（1號、2號、3號、5號、6號、7號、8號、9號、10號、11號和12號）屬于木霉屬（Trichoderma）真菌，分屬于6個種，分別為絨毛木霉（Trichoderma tomentosum）、毛簇木霉 （Trichoderma velutinum）、Trichoderma dorothopsis、貴州木霉（Trichoderma guizhouense）、綠木霉（Trichoderma virens）、哈茨木霉 （Trichoderma harzianum），1個菌株屬于青霉屬真菌類阿達青霉（Penicillium adametzioides）。

結(jié)果表明，引起紅托竹蓀腐爛病后期侵染的真菌主要是木霉屬真菌，且本次研究分離到的木霉屬有6個種，純化的11個菌株中每個種有1個～3個菌株，沒有特異性的致病種。因此，木霉屬的多種真菌均會引起紅托竹蓀菌蛋腐爛病后期感染，紅托竹蓀腐爛病防治措施中加強對木霉屬真菌的針對性防治尤為重要。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)目前的研究報道，培養(yǎng)溫度過高是引起紅托竹蓀菌腐爛病的誘因，栽培過程中，發(fā)生腐爛病害的大棚都有溫度持續(xù)超過32℃的情況發(fā)生，菌蛋長時間處于高溫條件下引起菌蛋表層免疫力低下，從而發(fā)生病害。也有菇農(nóng)發(fā)現(xiàn)栽培過程中有蚊蟲叮咬菌蛋后，叮咬部位會發(fā)生腐爛病，但尚未有明確的研究報道。不論是何種原因?qū)е碌母癄€病，目前均無針對性的治療措施。因此，導(dǎo)致菇農(nóng)只有根據(jù)目前的研究現(xiàn)狀和栽培經(jīng)驗，在紅托竹蓀栽培的過程中重點關(guān)注出菇溫度和蟲害防治，以減少病害發(fā)生的可能性。

開始進行栽培前需考慮出菇時的氣候條件，選擇合適的栽培時間；必要情況下在搭建大棚時要增加相應(yīng)的隔熱設(shè)施，出菇期嚴格監(jiān)控棚內(nèi)溫度情況；注意保持通風(fēng)換氣，溫度超過32℃時應(yīng)及時采取降溫措施。保持棚內(nèi)外環(huán)境清潔，及時清除周邊積水，減少蚊蟲滋生，合理使用防蚊網(wǎng)、黃板等設(shè)施進行蚊蟲阻隔和誘捕。

本次研究表明，木霉屬真菌是紅托竹蓀腐爛病后期侵染的主要真菌。木霉屬（Trichoderma）隸屬于子囊菌門 （Ascomycota）糞殼菌綱 （Sordariomycetes）肉座菌目 （Hypocreales）肉座菌科（Hypocreaceae），該屬真菌為世界性廣布種，土壤、植物殘體、空氣、海洋等都有分布[17-19]。木霉屬真菌為嗜溫型真菌，適宜在偏酸性、高溫高濕的環(huán)境中生長，孢子萌發(fā)和菌絲生長最適溫度為30℃左右，最適相對濕度為95%左右，生長最高溫度可達48℃，已有報道稱該屬的棘孢木霉（Trichoderma asperellum）會在高溫條件下引起刺芹側(cè)耳（Pleurotus eryngi）病害[20]。

盧穎穎等[16]的研究表明腐爛病發(fā)病部位組織菌絲并未死亡，因此盡管紅托竹蓀在出菇期發(fā)生了腐爛病，若能在產(chǎn)生病斑后及時進行木霉屬真菌的針對性防治，可有效減少二次感染，減少腐爛病后期真菌感染導(dǎo)致的大面積減產(chǎn)危害。在紅托竹蓀的栽培過程中，針對木霉屬真菌的生長特性，應(yīng)加強環(huán)境清潔，以減少周圍環(huán)境中木霉的滋生。如發(fā)現(xiàn)腐爛病病斑，應(yīng)盡快采取通風(fēng)降溫的相應(yīng)措施，降低棚內(nèi)溫度和空氣濕度，在棚內(nèi)外活動區(qū)域撒適量生石灰，創(chuàng)造不適宜木霉孢子萌發(fā)和菌絲生長的環(huán)境。適量使用疣霉凈、多菌靈等對木霉殺傷力較大、且在食用菌栽培中允許使用的農(nóng)藥，有針對性地防治木霉屬真菌，有效地降低紅托竹蓀腐爛病后期木霉屬真菌感染造成的二次病害。