283份小麥品種(系)萌發期耐鹽堿性評價及種質篩選

李媛媛, 陳博, 姚立蓉, 翟雪婷, 司二靜, 汪軍成,馬小樂, 孟亞雄, 王化俊, 李葆春*, 楊亮

(1.甘肅農業大學生命科學技術學院, 蘭州 730070; 2.甘肅農業大學農學院, 蘭州 730070)

土壤鹽堿化嚴重影響作物的產量和品質，已成為制約農業發展的主要因素之一[1]。據不完全統計，全球約有9.54億hm2鹽堿地[1-2]。我國西北地區鹽堿地多數是復合型鹽堿地，鹽堿成分主要是NaCl、NaHCO3和Na2CO3，并且鹽化和堿化現象相伴發生，鹽堿脅迫所導致作物產量的降低遠遠超過其他非生物脅迫所造成的總和，同時由于過度使用化肥和不合理的灌溉等因素還會引起耕地的次生鹽漬化[3]。小麥(TriticumaestivumL.)是僅次于水稻的主要糧食作物之一[4]。小麥可作為鹽堿地的主栽品種，對于鹽堿地的改良和治理具有重要意義[5]。

植物能否存活首先取決于能否發芽[3]，種子萌發期是植物生命史中最為重要的階段，也是對鹽堿脅迫最敏感的時期[5]。當鹽濃度高于90 mmol·L-1時，大豆發芽勢、發芽率和生物量都會降低，而堿性鹽則直接抑制大豆種子的萌發[6-7]。呂丙盛[8]研究發現,水稻種子受到鹽堿脅迫后，發芽率顯著降低，且Na2CO3比NaCl脅迫對水稻種子的萌發影響更大。另外，在大麥、高粱、玉米和花生上也有相關的鹽堿脅迫報道[9-11]。目前，對小麥耐鹽堿性的研究主要集中在中性鹽對小麥種質的幼苗生理特性和分子響應機制，而對于混合鹽堿脅迫的研究尚未見報道。本研究人工模擬自然環境下不同的鹽堿脅迫環境，明確不同小麥種質資源萌發期耐鹽堿性特點，篩選耐鹽堿基因型材料，以期為小麥耐鹽堿品種的培育及萌發期耐鹽堿相關分子機理的挖掘提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

283份小麥材料由甘肅省作物遺傳改良與種質創新重點實驗室/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室麥類種質創新課題組保存和提供。其中，我國地方品種59份，育成品種45份；歐洲引進品種179份，來自英國、德國、法國、波蘭、瑞典、保加利亞等國家。

1.2 試驗方法

1.2.1鹽、堿脅迫濃度篩選 隨機選取本實驗材料中的20個品種進行預實驗，設置鹽脅迫NaCl濃度為50、100、150、200、250 mmol·L-1，根據西北地區鹽堿地主成分，選取NaHCO3和 Na2CO3混合溶液(摩爾比為1∶1)進行堿脅迫，設置濃度梯度50、100、150、200、250 mmol·L-1。選取脅迫組與對照組性狀間具有明顯差異，但致死率不影響后期測定各性狀的濃度。結果表明，150 mmol·L-1NaCl為小麥耐鹽性篩選的理想鑒定濃度；100 mmol·L-1的 NaHCO3和 Na2CO3混合溶液(摩爾比為1∶1)為小麥耐堿性篩選的理想鑒定濃度。

1.2.2種子預處理及鹽、堿脅迫試驗 對283份小麥材料采用150 mmol·L-1NaCl模擬鹽脅迫，用100 mmol·L-1的 NaHCO3和 Na2CO3混合溶液(摩爾比為1∶1)模擬堿脅迫。將培養皿用75%的酒精進行消毒，且用蒸餾水沖洗三次，待風干后在底部鋪上2 層濾紙，一次性加入10 mL脅迫處理溶液。挑選30粒大小一致、籽粒飽滿的小麥種子，先用蒸餾水清洗2～3次，然后用5%的次氯酸鈉消毒5 min，最后用蒸餾水清洗5次。接著用滅菌的鑷子將種子腹股溝向下均勻地擺放至培養皿中，每個處理重復3次，最后將培養皿置于溫度為 20 ℃，光照時間為16 h晝/8 h夜，光強1 000 lx，相對濕度為40%～50%的條件下培養7 d。

1.3 測定指標

根據《國家種子檢驗規程》[12]，以胚根長≥種子長、胚芽長≥1/2種子長作為發芽標準。統計發芽勢(germination potential, GP)、發芽率(germination rate, GR)，并從每一處理中隨機挑選5株幼苗，測定根長(root length, RT)、芽長(bud length, BL)、胚芽鞘長(coleoptile length, CL)、根鮮重(root fresh weight, RFW)、根干重(root dry weight, RDW)、芽鮮重(bud fresh weight, BFW)、芽干重(bud dry weight, BDW)、幼苗鮮重(seedling fresh weight, SFW)及幼苗干重(seedling dry weight, SDW)等性狀指標。

發芽勢(GP)=3 d發芽種子數/供試種子數×100%

發芽率(GR)=7 d發芽種子數/供試種子數×100%

相對值=(對照值-脅迫值)/對照值

1.4 數據處理

對供試材料的所測性狀進行隸屬函數值法分析[2]，由于本試驗的數據都是采用相對值進行分析，因此隸屬函數值越小，表明其耐鹽堿性越強。

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)i=1, 2, 3,…,n

式中，U(Xi)指第i個綜合指標的隸屬函數值，Xi指第i個綜合指標值，Xmax指第i個綜合指標的最大值，Xmin指第i個綜合指標的最小值。

采用Excel 2010對試驗數據進行整理，使用SPSS19.0進行供試材料各性狀的相關分析、因子分析，R studio 進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度鹽脅迫下小麥萌發期性狀變化分析

對各性狀進行統計分析表明，株高、根長和生物量等性狀變幅不同(表1)。對照組中變異系數變化范圍較小，為10.9%～38.9%，說明供試的283份小麥種質資源在正常生長條件下各性狀變異不顯著。鹽脅迫處理組中變異系數在13.3%～104.8%，表明供試283份小麥種質資源在鹽脅迫條件下各性狀表現出較明顯的變異。其中胚芽長和胚芽干重的變異較大，分別為55.8%和104.8%。堿脅迫處理組中變異系數為18%～336.2%，表明供試的283份小麥種質資源在堿脅迫條件下各性狀表現出極顯著變異，其中根長、根鮮重和根干重變異系數較大，分別為336.2%、331%和275.4%。對照組和鹽堿脅迫組各性狀統計分析，結果表明，鹽脅迫組和堿脅迫組的幼苗干重均高于對照組，其余各指標脅迫組均低于對照組。

表1 鹽堿脅迫下283份小麥種質資源性狀統計

幼苗干重獲得方法為烘干后整株幼苗稱重，包括芽、根及種子的胚乳和種皮，其中未吸收完的胚乳占比仍然較大。對照組對胚乳的吸收轉化速率遠大于脅迫組，胚乳轉化為幼嫩的器官，風干后失水較多，干重變小；脅迫組幼苗生長速率較慢，對胚乳吸收轉化較少，當風干失水后，脅迫組種子胚乳的重量大，故脅迫組幼苗的干重要大于對照組。對鹽堿脅迫均值進行比對，發現鹽脅迫幼苗干重低于堿脅迫幼苗干重，其余各性狀均高于堿脅迫條件下各性狀值。

2.2 耐鹽堿性狀的相關性分析

根據表1選取在鹽堿脅迫下變異系數大的性狀：胚根長、胚根鮮重、胚根干重、胚芽長、胚芽鮮重、胚芽干重、幼苗干重和胚芽鞘長。對鹽堿脅迫下各性狀的隸屬函數值進行相關性分析(表2)。結果顯示，幼苗干重與其它性狀不具有相關性，胚根干重與胚芽長不具有相關性，其余各性狀之間具有顯著相關性。

表2 鹽脅迫下283份小麥種質資源11個性狀隸屬函數值間的相關系數

對堿脅迫下各性狀的隸屬函數值進行相關性分析(表3)。結果顯示，幼苗干重與其他性狀不具有相關性，胚芽鞘長與胚根長、胚根鮮重和胚根干重不具有相關性，其余各性狀之間顯著相關。

表3 堿脅迫下283份小麥種質資源11個性狀隸屬函數值間的相關系數

綜上表明，萌發期鹽、堿脅迫影響小麥幼苗多個性狀指標，單個性狀指標不能有效的評價小麥的耐鹽堿性，對多個性狀進行綜合分析才能準確的評價鹽、堿脅迫下的小麥萌芽期特性。

2.3 小麥萌發期鹽、堿脅迫相關性狀的主成分分析

對283份小麥材料隸屬函數值進行主成分分析，結果如表4、表5所示。鹽脅迫中第Ⅰ主成分貢獻率37.01% ,特征向量中最大的因子為胚芽鮮重；第Ⅱ主成分貢獻率15.79%,特征向量中最大的因子為胚根鮮重；第Ⅲ主成分貢獻率12.29%，特征向量中最大的因子為幼苗干重；第Ⅳ主成分貢獻率11.12%，特征向量中最大的因子為胚根長，累計貢獻率為76.2%。堿脅迫中第Ⅰ主成分貢獻率41.52%，特征向量中最大的因子為胚根干重；第Ⅱ主成分貢獻率18.84%，特征向量中最大的因子為胚芽鞘長；第Ⅲ主成分貢獻率12.53%，特征向量中最大的因子為胚芽鞘長；第Ⅳ主成分貢獻率10.71%，特征向量中最大的因子為胚根長，累計貢獻率為83.59%。

表4 4個鹽、堿脅迫下主成分的特征值以及貢獻率

表5 4個鹽、堿脅迫下主成分各因子的載荷矩陣

綜上分析發現，胚芽鮮重為鹽脅迫條件下小麥種質耐鹽性評價的主要因子，胚根干重為堿脅迫條件下小麥種質耐堿性評價的主要因子，與2.1研究結果一致。因此，可以考慮將胚芽鮮重和胚根干重作為小麥萌發期耐鹽堿的主要篩選指標。

2.4 耐鹽、堿材料聚類分析和種質資源篩選

根據主成分分析結果對供試材料進行聚類分析，參考單云鵬等[15]分析方法，鹽脅迫下以胚根鮮重、胚根干重和胚芽鮮重三個性狀的隸屬函數值平均值為聚類依據，如圖1所示。283份小麥材料劃分為3類，包括69份耐鹽型材料，隸屬函數平均值在0.45～0.27；152份中間型材料，隸屬函數平均值在0.24～0.19；62份鹽敏感型材料，隸屬函數平均值在0.18～0.03。鹽脅迫下三個類群生物量差異明顯，第Ⅰ類群材料胚根鮮重、胚根干重和胚芽鮮重的平均值最高，第Ⅲ類群材料胚根鮮重、胚根干重和胚芽鮮重平均值最低。

圖1 283個小麥品種鹽脅迫聚類分析

堿脅迫下以胚根干重、胚芽鮮重和胚芽干重三個性狀的隸屬函數值平均值為聚類依據，如圖2所示。283份小麥材料劃分為3類，包括11份耐堿型材料，隸屬函數平均值在0.75～0.55；29份中間型材料,隸屬函數平均值在0.50～0.41；243份堿敏感型材料，隸屬函數平均值在0.40～0.02。堿脅迫下三個類群生物量差異明顯，第Ⅰ類群材料胚根干重、胚芽鮮重和胚芽干重的平均值最高，第Ⅲ類群材料胚根干重、胚芽鮮重和胚芽干重平均值最低。

圖2 283個小麥品種堿脅迫聚類分析

共篩選出10份對鹽堿脅迫都具有耐受型材料：白芒麥、f106、和尚頭、四方麥、軸包、中梁22、f78、蚰子麥、和尚麥、矮立多。

3 討論

鹽堿地是世界性的熱點問題，嚴重限制著作物的生長發育和產量，因此,提高小麥耐鹽堿性、篩選小麥耐鹽堿品種(系)，對于提高小麥產量和保障國家糧食安全有十分重要的意義。小麥萌芽期是決定種子能否出苗的關鍵，對于小麥后期的生長發育起決定性作用。同時萌發期鑒定具有耗時短、操作性強、容量大和重復性好等特點，眾多學者將其作為衡量作物耐鹽堿性的重要依據[3,5-6]。小麥的耐鹽堿性是多基因控制的數量遺傳性狀[13]，由多種因素協同作用而形成，鑒于小麥耐鹽堿機理的復雜性，至今仍沒有發現哪一形態指標可以單獨作為其耐鹽堿性鑒定的依據，因此, 通過測定小麥萌發期各形態指標, 比較它們在鹽堿處理和對照間的差異, 評價不同品種耐鹽堿脅迫的能力, 可為小麥耐鹽堿育種提供依據[17]。

自然環境下鹽害主要由高濃度的Na+、Cl-造成。堿性土壤主要成分是Na2CO3和NaHCO3，同時堿性土壤具有較高的PH[18]。本研究采用NaCl作為鹽脅迫，Na2CO3和NaHCO3混合溶液作為堿脅迫，在前人研究的基礎上設計了鹽、堿脅迫濃度梯度，分析不同濃度鹽、堿脅迫對小麥材料的影響, 篩選出有差異且致死率低的濃度，適宜進行小麥萌發期鹽脅迫鑒定的NaCl溶液濃度為150 mmol·L-1，堿脅迫濃度為100 mmol·L-1的 NaHCO3和 Na2CO3混合溶液(摩爾比為1∶1)。

在植物鹽堿脅迫研究中，藺吉祥等[19-20]探討小麥種子萌發、早期幼苗生長及Na+、K+代謝對其的響應方式，結果表明，堿脅迫使小麥種子的發芽率、發芽速率及早期幼苗生長的下降幅度大于鹽脅迫。楊春武等[21]對鹽、堿脅迫下小冰麥的研究得出，芽期堿害的毒害作用要大于鹽害;石德成等[22]對鹽、堿脅迫下星星草的研究也得出相同結論。本研究中，在鹽堿脅迫處理下，通過對283份小麥材料萌發期性狀測定，利用隸屬函數對小麥各個性狀變化進行分析，幼苗干重平均值表現為：堿脅迫>鹽脅迫>CK，其余各性狀的平均值為：CK>鹽脅迫>堿脅迫。綜合各性狀指標得出堿脅迫對小麥萌芽期的影響要大于鹽脅迫對小麥的影響，與上述研究結果一致。通過對鹽堿脅迫下胚芽和胚根的性狀變化分析得出，芽對于鹽脅迫更為敏感，根對于堿脅迫更為敏感，此結論與索藝寧等[23]在水稻上對根系的研究結果一致。

對各性狀隸屬函數值進行主成分分析。鹽脅迫對于小麥胚芽具有較明顯的脅迫作用，因此胚芽長和胚芽干重可以作為耐鹽品種篩選的主要指標。王萍等[24]用NaCl處理冬小麥煙農19和克旱16得出地上部比地下部對NaCl脅迫更為敏感。韓朝紅等[25]用不同濃度的NaCl處理11個水稻品種吸脹后的種子，表明品種間的耐鹽能力具有一定的差異性，其地上部分對鹽害的敏感程度要高于根部對鹽害的敏感程度。本研究中小麥胚芽對鹽脅迫的敏感性要高于根系，與前人研究結果[24-25]一致。堿脅迫對于小麥的根系脅迫效果更為明顯，因此根長、根鮮重和根干重可以作為耐堿品種篩選的主要指標。索藝寧等[23]對水稻根系研究表明,在鹽脅迫和堿脅迫條件下, 水稻苗期的根數和根長都受到明顯影響，相對于鹽脅迫，水稻根系對堿脅迫更為敏感。本研究發現,小麥根系對堿脅迫的敏感性大于鹽脅迫的敏感性，與水稻根系受鹽堿脅迫的影響一致。

王芳等[26]在NaCl脅迫下對小麥胚芽鞘進行研究表明,鹽脅迫對小麥胚芽鞘具有抑制作用，一定濃度NaCl處理下小麥胚芽鞘的長度可作為耐鹽篩選的指標。本研究中鹽脅迫下胚芽鞘長與胚根和胚芽呈極顯著正相關(P<0.01)，所以鹽脅迫對小麥胚芽鞘具有影響，可以作為篩選耐鹽品種的指標，研究結果與王芳等[26]的結果較為一致。

采用三個主成分的隸屬函數值進行聚類分析，可以避免誤差，更具有代表性，對該群體小麥耐鹽堿性的評價更加可靠。283份小麥種質資源其芽期耐鹽堿性具有明顯差異，說明小麥品種經長時間的自然選擇和人工選擇, 對鹽害等逆境具有較強的適應性。本試驗對283份小麥品種分別進行鹽堿聚類，篩選出耐鹽堿小麥種質資源，可為小麥耐鹽堿品種的培育及萌發期耐鹽堿相關分子機理的挖掘提供參考依據。