耐輻射異常球菌黃嘌呤脫氫酶在氧化脅迫反應(yīng)中的作用

陳曉楠, 高麗華, 周正富, 張維, 陳明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 北京 100081)

眾所周知，過(guò)渡元素鉬是植物、動(dòng)物和微生物的必需營(yíng)養(yǎng)素。海洋中大量的鉬以陰離子形式存在。土壤中，鉬酸鹽陰離子是植物和細(xì)菌唯一可利用的鉬形態(tài)。鉬酶在生物地球化學(xué)氧化還原循環(huán)以及有機(jī)體代謝中具有關(guān)鍵作用[1]，根據(jù)鉬中心剩余配體的不同，鉬酶可分為AOR/XDH家族、亞硫酸鹽氧化酶家族和二甲基亞砜還原酶家族。同一鉬酶家族成員間具有明顯的序列相似性，不同家族成員間沒(méi)有明顯的同源性[2]。此類酶可在各種生理?xiàng)l件下以不同氧化態(tài)存在，具有多種功能，但都涉及氧化或還原反應(yīng)。

黃嘌呤脫氫酶(EC 1.17.1.4, xanthine dehydrogenase，XDH)是一種古老、典型、復(fù)雜的鉬酶，已有100多年的研究歷史，是迄今為止被研究得最深入的單核鉬酶，也是目前發(fā)現(xiàn)的四種鉬酶之一[3-4]。該酶催化次黃嘌呤氧化為黃嘌呤，黃嘌呤經(jīng)氧化為尿酸。此外，XDH還能催化雜環(huán)化合物嘌呤、喋呤和醛sp2雜環(huán)上碳原子的羥基化反應(yīng)[5]。XDH由3個(gè)氧化還原中心結(jié)構(gòu)域組成：鐵硫簇([2Fe-2S])、黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)和硫化鉬輔因子(molybdenum cofactor，Moco)。XDH的三個(gè)氧化還原中心構(gòu)成一個(gè)內(nèi)電子轉(zhuǎn)移鏈(electron transport chain，ETC)，在硫化鉬輔因子中心發(fā)生催化作用時(shí)，從底物中提取電子，然后轉(zhuǎn)移到鐵硫團(tuán)簇的FAD上，最后轉(zhuǎn)移到電子受體NAD+上形成NADH。在電子還原反應(yīng)中，反應(yīng)體系的完整性必不可少[6]。XDH廣泛分布在真核生物、細(xì)菌和古細(xì)菌中，并且在各種細(xì)胞過(guò)程中發(fā)揮重要作用，參與嘌呤代謝,催化黃嘌呤和次黃嘌呤生成酰脲類物質(zhì),且與氮同化、激素代謝、衰老的調(diào)控及活性氧產(chǎn)生等過(guò)程相關(guān)。

1902年，Schardinger[3]首次證明新鮮牛奶XDH可氧化甲醛，開(kāi)啟了XDH結(jié)構(gòu)和功能的研究。1960年，Bradshaw和Barker[7]首次從梭狀芽胞桿菌中純化出細(xì)菌中XDH，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多XDH被發(fā)現(xiàn)[8-11]。但僅對(duì)少量的XDH進(jìn)行了功能研究，如在固氮菌苜蓿中華根瘤菌中發(fā)現(xiàn)了與饑餓相關(guān)的XDH，在天藍(lán)色鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)了在應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中維持GTP穩(wěn)態(tài)的XDH等[12-13]。至今，仍有很多XDH尚未被鑒定，它們的生理功能不詳。

耐輻射異常球菌(D.radioduransR1)是目前已知物種中輻射、氧化抗性較強(qiáng)的生物[14-16]。D.radioduransR1基因組分析顯示，該菌含有完整的黃嘌呤脫氫酶基因簇，即鐵硫簇([2Fe-2S])編碼基因DR_A0233(xdhA)、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)編碼基因DR_A0232(xdhB)和硫化鉬輔因子(Moco)編碼基因DR_A0231(xdhC)。已報(bào)道的黃嘌呤脫氫酶均涉及氧化或還原反應(yīng)，因此，推測(cè)D.radioduransR1黃嘌呤脫氫酶在氧化脅迫抗性過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究構(gòu)建了黃嘌呤脫氫酶鐵硫亞基編碼基因xdhA的缺失突變株(ΔxdhA)，分析其在氧化脅迫條件下的表達(dá)情況，以及菌株的生存率和總抗氧化能力，探索黃嘌呤脫氫酶在氧化脅迫反應(yīng)中的功能，為充分了解耐輻射異常球菌氧化脅迫抗性及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1菌株及培養(yǎng)條件 耐輻射異常球菌R1野生型由本實(shí)驗(yàn)室保存；高頻轉(zhuǎn)化受體菌株大腸桿菌E.coliTop10購(gòu)自康為世紀(jì)公司；pRADZ3質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

大腸桿菌用LB培養(yǎng)基(10 g·L-1胰蛋白胨、5 g·L-1酵母提取物、10 g·L-1氯化鈉，固體培養(yǎng)基含15 g·L-1瓊脂)在37 ℃下培養(yǎng)；耐輻射異常球菌用TGY培養(yǎng)基(10 g·L-1胰蛋白胨、5 g·L-1酵母提取物、1 g·L-1葡萄糖，固體培養(yǎng)基含15 g·L-1瓊脂)在30 ℃下培養(yǎng)。突變株在含有卡那霉素(Km)的TGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)。抗生素卡那霉素(Km)和氯霉素(Cm)終濃度分別為50 μg·mL-1和17 μg·mL-1。

1.1.2主要試劑 T4-DNA連接酶及限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司，RNA消化反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自Magen公司，Taq酶及SYBR Green Mix購(gòu)自Vazyme公司，質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Magen公司，RNA提取試劑盒購(gòu)自Analytik Jena公司。總抗氧化能力檢測(cè)由碧云天公司完成。基因測(cè)序及引物(表1)合成均由華大基因完成。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1xdhA基因的生物信息學(xué)分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得D.radioduransR1的xdhA基因(NC_001264.1)及蛋白(Q9RYS5)序列信息；使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/)查看并分析xdhA基因參與調(diào)控的代謝途徑及發(fā)揮功能的相關(guān)基因；利用Blastp(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)以及Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)與XdhA蛋白相似性較高且已確定功能的蛋白，初步判斷該蛋白所屬的家族及其生理功能。

1.2.2缺失突變株和回補(bǔ)株構(gòu)建 構(gòu)建各菌株所需引物如表1所示。根據(jù)xdhA及其上下游序列、pKatAPH3以及pRADZ3載體序列設(shè)計(jì)所用引物，同時(shí)利用DNAMAN軟件分析xdhA及pRADZ3內(nèi)存在的酶切位點(diǎn)。

采用融合PCR法構(gòu)建xdhA缺失突變株：以D.radioduransR1基因組DNA為模板，利用引物xdhA-U-F/R擴(kuò)增xdhA上游序列xdhA-U(304 bp)；利用引物xdhA-D-F/R擴(kuò)增xdhA下游序列xdhA-D(350 bp)。以pKatAPH3質(zhì)粒為模板，利用引物Km-F/R擴(kuò)增抗性盒序列Km(920 bp)。將擴(kuò)增產(chǎn)物分別回收純化后進(jìn)行融合PCR，以等摩爾質(zhì)量的三個(gè)片段為模板，利用引物xdhA-U-F和xdhA-D-R進(jìn)行擴(kuò)增，得到融合片段UKD。融合PCR反應(yīng)體系：2×Mix 25 μL，模板xdhA-U 2 μL，模板Km 2 μL，模板xdhA-D 2 μL，引物xdhA-U-F和xdhA-D-R各1 μL，ddH2O 17 μL。融合PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 2 min，10個(gè)循環(huán)；暫停，冰上添加引物，反應(yīng)繼續(xù)；96 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，25個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，10 ℃保溫。純化后的融合片段轉(zhuǎn)化野生型D.radioduransR1，用含Km的抗性培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，隨后進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以突變株基因組為模板，利用引物YZ-F/R，Km-F/R分別擴(kuò)增融合片段和Km抗性盒片段，同時(shí)設(shè)置野生型D.radioduransR1基因組為對(duì)照。

采用質(zhì)粒回補(bǔ)的方式構(gòu)建回補(bǔ)株cmxdhA：以D.radioduransR1基因組為模板，利用引物xdh-SpeI-F、xdh-BamHI-R擴(kuò)增xdhABC基因簇Pcm(3 820 bp)，回收純化后進(jìn)行酶切連接，構(gòu)建重組載體Pcm-Z3,轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行富集，隨后將從大腸桿菌中提取的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化xdhA缺失突變株。用含Km、Cm的抗性平板進(jìn)行篩選，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。以回補(bǔ)株基因組DNA為模板，利用引物Z3-F/R、xdhA-F/R以及Km-F/R(表1)擴(kuò)增片段，同時(shí)設(shè)置野生型D.radioduransR1基因組和突變株ΔxdhA基因組作為對(duì)照。得到回補(bǔ)株，命名為cmxdh。

1.2.3熒光定量PCR 生長(zhǎng)到穩(wěn)定期的野生型菌株D.radioduransR1轉(zhuǎn)接到新鮮的200 mL TGY液體培養(yǎng)基中，初始OD600為0.1，30 ℃、220 r·min-1培養(yǎng)至對(duì)數(shù)初期(OD600=0.6～0.8)。菌液中加入相應(yīng)體積的30% H2O2，使其終濃度為80 mmol·L-1，避光處理30 min。將菌液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的50 mL離心管中，4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，PBS(0.24 g·L-1KH2PO4，1.44 g·L-1Na2HPO4，8 g·L-1NaCl，0.2 g·L-1KCl，pH 7.4)洗滌菌體。隨后將菌體用等體積新鮮的TGY培養(yǎng)基重懸，30 ℃、220 r·min-1孵育，每隔1 h收集菌體。

為分析xdhA基因缺失對(duì)氧化脅迫抗性相關(guān)基因表達(dá)的影響，依照上述方法處理D.radioduransR1、ΔxdhA菌株，同時(shí)設(shè)置不添加H2O2的對(duì)照。4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min收集菌體，利用試劑盒提取總RNA，消化反轉(zhuǎn)為cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，對(duì)氧化脅迫條件下基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。

1.2.4腺嘌呤及甲醛毒性檢測(cè) 將活化野生型D.radioduransR1及突變株ΔxdhA分別按照OD600為0.1轉(zhuǎn)接到加入相應(yīng)抗性的20 mL新鮮TGY培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)至穩(wěn)定期。將菌液轉(zhuǎn)移至50 mL無(wú)菌離心管中，4 ℃、6 000 r·min-1離心10 min收集菌體；隨后用PBS洗滌菌體(兩次)。用基本培養(yǎng)基重懸菌體，按照OD600為0.1將菌懸液轉(zhuǎn)接到基本培養(yǎng)基或添加0.1%腺嘌呤的基本培養(yǎng)基中(每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù))，使得初始OD600為0.1。30 ℃、220 r·min-1震蕩培養(yǎng)，每隔2 h取樣，測(cè)定OD600值。

檢測(cè)甲醛毒性的過(guò)程與檢測(cè)腺嘌呤毒性的過(guò)程相似，用PBS洗滌菌體后，用20 mL 0.1×TGY重懸。按OD600為0.1將菌懸液轉(zhuǎn)接到0.1×TGY或添加甲醛(400 μmol·L-1)的0.1×TGY中，用芬蘭BioScreenC全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀(Oy Growth Curves Ab Ltd)對(duì)其生長(zhǎng)趨勢(shì)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

1.2.5菌株生存能力及總抗氧化能力測(cè)定 培養(yǎng)到穩(wěn)定期的野生型D.radioduransR1、突變株ΔxdhA、回補(bǔ)株cmxdh按OD600為0.1分別轉(zhuǎn)接到新鮮無(wú)抗生素的100 mL TGY液體培養(yǎng)基中，待其生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)初期(OD600=0.6～0.8)進(jìn)行能力測(cè)定。①菌株生存能力：分別取1 mL菌液，4 000 r·min-1離心5 min收集菌體，隨后用1 mL PBS重懸。避光條件下，分別加入相應(yīng)體積的30% H2O2，使其終濃度為60 mmol·L-1。30 ℃、220 r·min-1避光處理30 min。設(shè)置不添加H2O2溶液的CK組作為對(duì)照。處理后的菌液進(jìn)行倍比稀釋(100 μL菌液+900 μL 1×PBS)，至10-5。充分混勻，每個(gè)梯度取菌液8 μL，按順序點(diǎn)在TGY固體培養(yǎng)基上，每個(gè)樣品平行三次，30 ℃、220 r·min-1倒置培養(yǎng)2～3 d后對(duì)比生長(zhǎng)狀況，判斷菌株的生存能力。②總抗氧化能力測(cè)定：避光條件下，分別加入相應(yīng)體積的30% H2O2使其終濃度分別為80 mmol·L-1。設(shè)置不添加H2O2溶液的CK組作為對(duì)照。30 ℃、220 r·min-1避光處理30 min后4 ℃離心收集菌體。收集的菌體用5 mL PBS重懸，隨后利用超聲細(xì)胞破碎儀進(jìn)行細(xì)胞破碎，直至溶液澄清。離心除去殘?jiān)厥丈锨澹捡R斯亮藍(lán)法[17]測(cè)定上清中總蛋白濃度。

1.2.6數(shù)據(jù)分析 相關(guān)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；用GraphPad Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果分析

2.1 xdhABC基因簇組成分析和鑒定

KEGG結(jié)果顯示，xdhABC基因簇(DR_A0233、DR_A0232、DR_A0231)編碼功能性XDH。Blast與Uniprot在線預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，XdhC蛋白與天藍(lán)色鏈霉菌XDH蛋白鉬結(jié)合亞基具有53%的相似性(41%)，XdhB蛋白與黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)結(jié)合亞基具有60%的相似性(51%)，XdhA蛋白與[2Fe-2S]結(jié)合亞基具有71%的相似性(58%)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，xdhABC基因簇編碼功能性黃嘌呤脫氫酶。

利用在線工具Biocy對(duì)三個(gè)基因間關(guān)系進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)xdhABC三個(gè)基因位于同一操縱子，為確認(rèn)三者間存在共轉(zhuǎn)錄關(guān)系，以野生型D.radioduransR1基因組及cDNA為模板，設(shè)計(jì)跨基因引物對(duì)xdhA、xdhB和xdhB、xdhC間序列進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果(圖1B)顯示，在不同模板中兩段序列都能擴(kuò)增出來(lái)，表明xdhA與xdhB、xdhC三個(gè)基因間存在共轉(zhuǎn)錄關(guān)系。

注：黑色方框表明與參考基因的相似性在70%以上，灰色的方框表示與參考基因的相似性為50%～60%。M為T(mén)rans2K Plus Ⅱ marker；甬道1、4、7: D.radiodurans R1基因組為模板；甬道2、5、8: D.radiodurans R1 cDNA為模板；甬道1、2: 驗(yàn)證xdhB、xdhC間是否共轉(zhuǎn)錄；甬道3、6：陰性對(duì)照，以H2O為模板；甬道4、5：陰性對(duì)照；甬道7、8：驗(yàn)證xdhB、xdhA間是否共轉(zhuǎn)錄。

2.2 xdhA基因的生物信息學(xué)分析

進(jìn)一步對(duì)同一操縱子xdhABC的三個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，野生型菌株D.radioduransR1中xdhABC相對(duì)表達(dá)量無(wú)明顯差異，ΔxdhA菌株中，xdhBC幾乎不表達(dá)(圖 2)，由于xdhA片段被Km抗性盒替換，而Km抗性盒上游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄方向與xdhABC的轉(zhuǎn)錄方向相反，從而造成xdhBC基因簇均無(wú)表達(dá)。因此，敲除xdhA基因，導(dǎo)致xdhABC基因簇不能表達(dá)，即ΔxdhA菌株不能形成XdhABC蛋白。

圖2 xdhABC基因簇相對(duì)表達(dá)量

采用質(zhì)粒回補(bǔ)的方法構(gòu)建xdhA的回補(bǔ)株cmxdh，利用酶切連接的方法構(gòu)建重組載體Pcm-Z3，該載體包含完整的xdhABC基因序列。Km抗性盒鑒定結(jié)果表明，在cmxdh基因組中存在Km抗性盒基因；載體上引物Z3-F/R擴(kuò)增結(jié)果顯示回補(bǔ)株cmxdh基因組中重組載體的存在。以上結(jié)果表明,帶有目的片段的質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入ΔxdhA中，獲得回補(bǔ)株cmxdh。

2.3 xdhA基因缺失菌株對(duì)腺嘌呤及甲醛敏感性分析

為研究xdhABC編碼蛋白的功能，本研究嘗試在大腸桿菌中表達(dá)該蛋白，并獲得三條大小相符的蛋白帶，但未能測(cè)定到相應(yīng)酶活。由于黃嘌呤脫氫酶可催化嘌呤及簡(jiǎn)單醛類的降解，對(duì)醛類物質(zhì)具有一定的解毒作用。因此，本研究通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)探究xdhABC編碼蛋白的功能。結(jié)果(圖3)表明，基本培養(yǎng)基中添加0.1%腺嘌呤時(shí)，菌株的生長(zhǎng)明顯受到抑制，野生型與突變株間具有差異；添加甲醛后ΔxdhA生存能力下降，16 h時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期，隨后細(xì)胞逐漸死亡；而野生型D.radioduransR1生存能力較突變株強(qiáng)，32 h時(shí)到達(dá)穩(wěn)定期。以上結(jié)果說(shuō)明，xdhA缺失導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)外源性腺嘌呤及甲醛的敏感性，該操縱子xdhABC編碼蛋白參與嘌呤代謝及甲醛解毒過(guò)程，符合前面預(yù)測(cè)的結(jié)果，即xdhABC基因簇編碼功能性黃嘌呤脫氫酶。

A：基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線；B：基本培養(yǎng)基添加腺嘌呤后生長(zhǎng)曲線；C：0.1×TGY培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線；D：0.1×TGY培養(yǎng)基中添加400 μmol·L-1甲醛后生長(zhǎng)曲線。

2.4 氧化脅迫條件下基因表達(dá)水平分析

非生物脅迫條件下目的基因的相對(duì)表達(dá)水平如圖4所示，氧化處理孵育兩小時(shí)xdhA的表達(dá)量達(dá)到最大，較未孵育前上調(diào)約7倍，隨后降低至未孵育前的水平。表明xdhA基因的表達(dá)受到氧化脅迫條件的誘導(dǎo)。

過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶以及過(guò)氧化物酶等均在D.radioduransR1發(fā)揮氧化脅迫抗性中具有重要作用。上述結(jié)果表明，xdhA基因在D.radioduransR1的抗氧化機(jī)制中具有功能，參與氧化脅迫抗性相關(guān)基因表達(dá)情況(圖4)表明，xdhA基因的缺失使得氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生不同程度的下調(diào)，轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子DrRRA下調(diào)幅度較小。

圖4 H2O2處理30 min后不同孵育時(shí)間xdhA基因及氧化脅迫相關(guān)基因的表達(dá)情況

2.5 xdhA基因缺失菌株對(duì)氧化脅迫抗性分析

為研究氧化脅迫條件下XDH的功能，對(duì)野生型D.radioduransR1、突變株ΔxdhA、回補(bǔ)株cmxdh進(jìn)行了H2O2沖擊試驗(yàn)及總抗氧化能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)。從圖5可以看出，在正常培養(yǎng)條件下(不添加H2O2)，D.radioduransR1、ΔxdhA、cmxdh生長(zhǎng)保持一致；60 mmol·L-1H2O2處理30 min后，突變株ΔxdhA的氧化耐受能力較野生型D.radioduransR1減弱2個(gè)數(shù)量級(jí)，回補(bǔ)株cmxdh可以完全恢復(fù)突變株的氧化抗性。在未處理?xiàng)l件下，各菌株細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力沒(méi)有明顯的差別；而經(jīng)氧化處理后，野生型D.radioduransR1、突變株ΔxdhA以及回補(bǔ)株cmxdh菌體的總抗氧化能力均有所下降，其中突變株ΔxdhA總抗氧化能力明顯減弱。

注：*表示差異顯著(P<0.05)。

由此可見(jiàn)，xdhA基因缺失使得菌株對(duì)氧化脅迫更加敏感。表明xdhA基因的缺失使得細(xì)菌的氧化脅迫抗性減弱，推測(cè)黃嘌呤脫氫酶在D.radioduransR1超強(qiáng)氧化脅迫抗性機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

3 討論

Xi等[18]對(duì)大腸桿菌黃嘌呤脫氫酶功能研究表明，xdhA對(duì)于XDH產(chǎn)生活性是必要的。Moco中心產(chǎn)生的底物羥基化后產(chǎn)生的電子通過(guò)2Fe-2S到達(dá)FAD，隨后在FAD位點(diǎn)將電子轉(zhuǎn)移到NAD+形成NADH[19]，電子傳遞過(guò)程需要整個(gè)電子傳遞鏈的完整性。本研究在進(jìn)行回補(bǔ)株構(gòu)建時(shí)發(fā)現(xiàn)，僅用xdhA基因進(jìn)行回補(bǔ)時(shí)，不能恢復(fù)ΔxdhA氧化脅迫抗性，其細(xì)胞總抗氧化能力與ΔxdhA相當(dāng)；而用含有完整的xdhABC基因進(jìn)行回補(bǔ)ΔxdhA，能完全恢復(fù)突變株氧化脅迫抗性的表型，其細(xì)胞的總抗氧化能力與野生型菌株無(wú)差異。表明在耐輻射異常球菌中，xdhA是黃嘌呤脫氫酶活性所必需的，完整的xdhABC基因簇的產(chǎn)物共同構(gòu)成一個(gè)完整的黃嘌呤脫氫酶，發(fā)揮其功能。

細(xì)菌黃嘌呤脫氫酶具有廣泛的底物特異性，能夠氧化各種嘌呤和醛類化合物。黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸的反應(yīng)是嘌呤分解代謝的第一步[18,20]。黃嘌呤脫氫酶缺失突變的菌株不能正常代謝嘌呤，使腺嘌呤合成鳥(niǎo)嘌呤核苷酸途徑受阻，導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)腺嘌呤產(chǎn)生敏感性[21]。醛類化合物對(duì)細(xì)胞具有毒害作用，包括化學(xué)損傷、對(duì)細(xì)胞糖酵解和發(fā)酵過(guò)程的直接抑制以及質(zhì)膜損傷[20]。黃嘌呤脫氫酶能氧化醛類化合物，有效降低醛類化合物對(duì)細(xì)胞的毒害作用。本研究結(jié)果顯示，xdhA基因缺失導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)外源性腺嘌呤及甲醛的敏感性，表明基因xdhA編碼的蛋白參與嘌呤代謝及甲醛解毒過(guò)程，其與xdhBC編碼的蛋白組成的酶具有黃嘌呤脫氫酶的特性。

黃嘌呤脫氫酶是一種高度保守的管家酶，嘌呤類底物氧化產(chǎn)生的尿酸可作為ROS清除劑來(lái)維持氧化還原的穩(wěn)態(tài)[22]。尿酸是一種高效的活性氧清除劑，可清除細(xì)胞內(nèi)羥基自由基、超氧陰離子和單態(tài)氧，被認(rèn)為是生物重要的抗氧化劑[23-24]。尿酸也可能有助于D.radioduransR1抵抗高水平氧化應(yīng)激[25-26]。SOD暴露于H2O2時(shí)由于產(chǎn)生SOD-Cu-·OH而被滅活，生理水平的尿酸可以保持SOD酶的活性，阻止氧自由基的產(chǎn)生[24]。本研究結(jié)果顯示，編碼黃嘌呤脫氫酶鐵硫亞基的xdhA基因的缺失導(dǎo)致菌株對(duì)腺嘌呤、甲醛及H2O2脅迫敏感，同時(shí)導(dǎo)致菌株細(xì)胞內(nèi)總抗氧化能力下降。推測(cè)D.radioduransR1黃嘌呤脫氫酶通過(guò)嘌呤代謝途徑產(chǎn)生尿酸抑制氧自由基形成，并維持SOD酶的活性，提高細(xì)胞氧化脅迫抗性。此外，轉(zhuǎn)錄分析結(jié)果顯示，在氧化脅迫條件下，xdhA基因的缺失導(dǎo)致參與氧化脅迫反應(yīng)重要的酶和轉(zhuǎn)錄因子，如過(guò)氧化氫酶基因(katE)、過(guò)氧化物酶基因(pod)及超氧化物歧化酶(sod)表達(dá)發(fā)生明顯的下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子DrRRA表達(dá)量也有較小幅度的下調(diào)。xdhA基因產(chǎn)物是黃嘌呤脫氫酶氧化還原中心重要的組成部分，其缺失直接影響嘌呤代謝途徑。同時(shí)xdhA基因缺失可能通過(guò)未知的途徑間接地影響到氧化脅迫反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，其作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。