UPLC-MS/MS同時檢測蔬菜中三種殺菌劑殘留的研究

黃麗, 鄧毅書, 浦恩堂, 代雪芳, 李文希

(1.云南農業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 昆明 650201; 2.云南省農業(yè)科學院農業(yè)環(huán)境資源研究所, 昆明 650205)

蔬菜中的農藥殘留是一個社會熱點問題，農藥殘留不僅對人體健康和環(huán)境帶來潛在危害，引發(fā)社會對食品安全的恐慌，還對我國的農產品出口貿易產生極大影響[1]，因此食品中的農藥檢測顯得尤其重要。烯酰嗎啉(dimethomorph)是一種羧酸酰胺類真菌殺菌劑，化學式為C21H22ClNO4；霜脲氰(cymoxanil)是一種脲類殺菌劑，化學式為 C7H10N4O3；唑嘧菌胺(ametoctradin)是一種三唑嘧啶類殺菌劑，化學式為C15H25N5。這三種殺菌劑主要用于防治卵菌病害，對馬鈴薯、番茄、茄子等蔬菜的卵菌病害具有優(yōu)良的治療作用，因此廣泛應用于蔬菜晚疫病、霜霉病等疾病的防治。

目前，烯酰嗎啉的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[2-3]、氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)[4-5]、高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術(UPLC-MS/MS)[6]，霜脲氰的檢測方法主要有高效液相色譜法(UPLC)[7-8]，唑嘧菌胺的檢測方法有超高效液相色譜法(UPLC)[9]，這些方法大多前處理條件復雜，凈化條件苛刻，耗時長且成本高。并且，因烯酰嗎啉、霜脲氰、唑嘧菌胺復配使用能減少抗性，通常以復配的形式在蔬菜中使用，所以單一農藥檢測方法已經(jīng)不能滿足快速檢測要求，而食品中農藥最大殘留限量(GB 2763—2019)[10]中也沒有規(guī)定唑嘧菌胺的標準檢測方法。本研究基于 UPLC-MS/MS技術，旨在優(yōu)化前處理技術，建立一種能同時快速檢測蔬菜基質中烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的分析方法，為其快速檢測提供技術支持。經(jīng)研究證明，該方法準確度、靈敏度、精密度均符合農藥殘留試驗準測(NY/T 788—2018)[11]的要求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試樣品：選取當?shù)厥袌鍪圪u的馬鈴薯、茄子、蘿卜和西紅柿為代表性蔬菜，取可食部分用破壁機打碎。

儀器：Waters Xevo TQD三重四極桿液質聯(lián)用儀(Waters公司)；AE100電子分析天平(梅特勒公司)；PL620-S電子天平(梅特勒公司)；TARGIN VXIII多管渦旋振蕩儀；LXJ-IIB 低速大容量多管離心機(上海飛鴿)；1-14臺式小型離心機(希格瑪公司)；破壁機(沃健佳)。

試劑：純度96.2%的烯酰嗎啉標準品(常隆公司)；純度99.9%的霜脲氰標準品(Dr公司)；純度99.7%的唑嘧菌胺標準品(Dr公司)；色譜純甲醇、乙腈(Merck公司)；優(yōu)級純甲酸(安普公司)；分析純MgSO4、NaCl(國藥公司)；C18、N-丙基乙二胺(PSA)(上海斯信生物科技公司)、石墨化碳(Agilent公司)、蒸餾水(屈臣氏)。

1.2 溶液配制

標準儲備液：準確稱取烯酰嗎啉標準品0.010 4 g，乙腈定容至10 mL，配制濃度為1 000 μg·mL-1的標準儲備液；準確稱取霜脲氰標準品0.010 0 g，乙腈定容至10 mL，配制濃度為1 000 μg·mL-1的標準儲備液；準確稱取唑嘧菌胺標準品0.010 1 g，乙腈定容至10 mL，配制濃度為1 007 μg·mL-1的標準儲備液，5 ℃避光保存。

混合標準溶液：準確吸取上述各儲備液1 mL，用乙腈定容至10 mL，配制成100.0 μg·mL-1的混合標準儲備液，然后按照此方法逐步稀釋為10.0、1.0、0.1 μg·mL-1的混合標準工作液，4 ℃下保存。

溶劑標準工作液：分別移取900 μL乙腈于2 mL離心管中，再移取100 μL的10 μg·mL-1混合標準溶液于2 mL離心管中，后用乙腈逐級稀釋為1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg·mL-1的溶劑標準工作液。

基質匹配標準工作液：分別移取900 μL空白基質凈化液于2 mL離心管中，再移取100 μL的10 μg·mL-1混合標準溶液于2 mL離心管中，后用空白基質凈化液逐級稀釋成1.0、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01、0.005、0.002、0.001 μg·mL-1的溶劑標準工作液。

1.3 試驗方法

1.3.1試驗設計 以添加回收率為指標，添加回收率越接近100%，效果最好[11]。設置乙腈(A1)、1∶1的乙腈-0.1%甲酸水(A2)、1∶1的乙腈-水(A3)、甲醇(A4)共4種不同提取劑，以及5 g NaCl(B1)、2.5 g NaCl+2 g MgSO4(B2)、5 g MgSO4(B3)、4 g NaCl+1 g MgSO4(B4)、4.5 g NaCl+0.5 g MgSO4(B5)共5種不同配比的鹽析材料，考察不同提取劑和不同鹽析材料的提取效率。設置C18+GCB(C1)、C18(C2)、C18+PSA(C3)、GCB+PSA(C4)、PSA(C5)、GCB(C6)、C18+PSA+GCB(C7)共7種組合凈化劑，比較分析不同凈化劑的凈化效率。綜合提取劑、鹽析材料和凈化劑的最佳組合，在空白樣品中添加了0.005、0.05、0.5、1.0 mg·kg-14個濃度的混合農藥溶液，做5次平行回收試驗，以標準曲線定量，通過考察烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺在蔬菜基質中的線性方程、相關系數(shù)、準確度、精密度、檢出限和基質效應對所建立的方法進行驗證。

采用相對響應值法對基質產生的基質效應(matrix effect，ME)做出評價。基質效應計算公式如下。

ME=B/A×100%

式中，B指目標物在標準溶液中的峰面積之和，A指目標物在基質匹配標準溶液中的峰面積之和。

ME>100%，表現(xiàn)為基質增強效應；ME<100%，表現(xiàn)為基質抑制效應；80%

1.3.2樣品處理 稱取5.0 g打碎樣品于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，振蕩提取5 min，加入4 g NaCl+1 g MgSO4，振蕩1 min，3 000 r·min-1離心5 min。取上清液1 mL于裝有50 mg C18的2 mL的離心管中，渦旋混勻3 min，14 700 r·min-1離心3 min。取上清液，過0.22 μm濾膜，UPLC-MS/MS進樣分析。

1.3.3UPLC-MS/MS檢測條件 色譜分析條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱，柱溫40 ℃，樣品室溫度為室溫，進樣體積為1 μL，流速為0.4 mL·min-1，流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：甲醇。梯度洗脫條件見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序

質譜分析條件：質譜電子轟擊離子源為ESI，正離子模式(ES+)掃描，多反應監(jiān)測模式(MRM)進行數(shù)據(jù)掃描；離子源溫度為150 ℃；脫溶劑氣流速溫度為350 ℃；脫溶劑氣流速800 L·h-1；毛細管電壓2.9 kV；錐孔氣速50 L·h-1，通過對毛細管電壓、碰撞能等質譜參數(shù)的最佳優(yōu)化，最終確定烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定性和定量離子對及對應質譜條件(表2)。

表2 3種農藥MRM模式下的檢測條件

2 結果與分析

2.1 樣品前處理條件的選擇和優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的選擇 從不同提取溶劑的回收率(圖1)可以看出，當提取溶劑為乙腈(A1)時，3種化合物的回收率在92.7%～102%之間，由于乙腈的極性范圍廣，對樣品基質有較強的滲透作用，提取的色素雜質少，有助于后期的鹽析和凈化。提取溶劑為0.1%甲酸水-乙腈(A2)和乙腈-水(A3)時，烯酰嗎啉和霜脲氰兩種目標物的提取效率大于260%，大大超出了回收率的限值，可能是因為水的極性范圍廣，提取目標物的過程中也能提取到一些其他雜質，對儀器分析帶來干擾，最終影響目標化合物的定性和定量。采用甲醇(A4)作為提取溶劑時，其回收率為62%～72%，回收率太低。因此，選取乙腈為3種混合農藥的提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對3種殺菌劑的提取效率

2.1.2鹽析材料的選擇 在鹽析輔助均相液相萃取中最常用的鹽是NaCl和MgSO4。但因Mg2+的離子電位高，水相的離子強度大，而NaCl與目標物存在相互作用，常常影響萃取效率[13]。因此，本研究比較了不同配比鹽析材料的除水效果，不同處理的回收率結果見圖2，可見，當使用5 g NaCl(B1)作為鹽析材料時，烯酰嗎啉的回收率可達到110%，當使用5 g MgSO4(B3)作為鹽析材料時，霜脲氰的回收率可達到128%，偏高；當使用2.5 g NaCl+ 2.5 g MgSO4(B2)作為鹽析材料時，唑嘧菌胺的回收率偏低，僅有81%。綜合三種目標物的回收率，最終選取4 g NaCl+1 g MgSO4(B4)作為鹽析材料。

圖2 不同鹽析材料對農藥回收率的影響

2.1.3凈化劑的選擇 快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全等特點已成為現(xiàn)在國際上主要的凈化技術研究方向，吸附材料主要是通過離子相互作用、非極性相互作用、極性相互作用等選擇性地去除和保留基質中的干擾成分，從而實現(xiàn)凈化的目的[12]。不同凈化劑的回收率結果見圖3，可見，當采用PSA(C5)作為凈化劑時，烯酰嗎啉的回收率偏高，但采用GCB(C6)作為凈化劑時，烯酰嗎啉和霜脲氰的回收率均太低，只有采用C18(C2)作為凈化劑時，3種目標化合物的回收率均在96.4%～101%之間，達到最理想的效果。因此，本研究最終選取C18作為最終的凈化材料。

圖3 不同凈化劑對目標物回收率的影響

2.2 基質效應的評價

基質效應(ME)是指提取基質中的目標物時，基質中的干擾物影響目標化合物的離子化，使得目標化合物在儀器上的響應發(fā)生了增強或者抑制的現(xiàn)象。為提高目標化合物的測定準確度，需要對不同基質產生的基質效應做出評價，并選擇合適的方法減小基質效應的干擾[14]。對3種藥劑在蔬菜中的基質效應進行評價，結果(表3)顯示，基質效應在94.22%～108.74%范圍內[12]，因此該基質效應可忽略。

2.3 方法學驗證

2.3.1線性關系和定量限 以質量濃度為橫坐標(x)，定量離子的峰面積為縱坐標(y)，進行回歸分析。3種目標物在不同基質中的線性方程、相關系數(shù)、線性范圍和定量限結果見表3，可見，在0.001～1.0 μg·mL-1范圍內，3種目標化合物在不同基質中的相關系數(shù)r均大于0.999 0，線性關系良好，說明在該測定條件下3種農藥檢測結果是可信的。取信噪比S/N=10確定定量限，烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定量限均為0.005 mg·kg-1。

表3 3種目標物的基質效應、線性關系和定量限

2.3.2回收率和精密度 添加不同分析物濃度的馬鈴薯、西紅柿、茄子和蘿卜測得的回收率結果見表4。可見，烯酰嗎啉在蔬菜中的平均加標回收率為87.3%～105.7%，相對標準偏差為1.5%～11.0%；霜脲氰在蔬菜中的平均加標回收率為85.4%～113.4%，相對標準偏差為0.5%～10.9%；唑嘧菌胺在蔬菜中的平均添加回收率為80.9%～108.4%，相對標準偏差為2.8%～10.2%。結果表明，該方法的準確度和精密度均符合農藥殘留分析要求[11]。

表4 3種目標物在蔬菜基質中的添加回收率均值和相對標準偏差

3 討論

本研究通過超高液相色譜分離和串聯(lián)質譜檢測方法，優(yōu)化了提取劑、鹽析材料和吸附劑的組合，簡化了前處理步驟，降低了樣品基質的干擾，保證了分析結果的準確性。結果表明，樣品經(jīng)乙腈提取，十八烷基硅烷(C18)分散固相萃取凈化，HSS T3色譜柱分離待測物，甲醇-0.1%甲酸水為流動相梯度洗脫，正負離子分段掃描和多反應檢測模式(MRM)檢測，基質匹配標準溶液外標法定量，其精密度、準確度和靈敏度均符合農藥殘留分析要求。

通過取10倍信噪比來確定定量限，烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的定量限均為0.005 mg·kg-1，根據(jù)中國《食品中農藥最大殘留限量》(GB2763—2019)[10]標準，烯酰嗎啉在蔬菜類中的最大殘留限量(MRL)值最小為0.05 mg·kg-1，霜脲氰在蔬菜類中的MRL值最小為0.2 mg·kg-1，唑嘧菌胺在蔬菜類中的MRL值最小為0.05 mg·kg-1。因此，該方法的靈敏度能滿足烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺檢測需要。

該方法具有基質干擾小、高通量、萃取效率高、操作簡單、分析快、溶劑用量少、成本低等優(yōu)點，滿足農殘檢測分析中高效率、高通量、低成本的要求，能為蔬菜中烯酰嗎啉、霜脲氰和唑嘧菌胺的消減動態(tài)和最終殘留研究提供方法保證，對維護食品安全具有重要意義。對于一些復雜基質，本研究所采取的凈化劑的凈化效果和適用性仍然可能有一些局限性，可能需要對前處理條件進一步優(yōu)化以獲得更好的結果。試驗過程中發(fā)現(xiàn)鹽析材料NaCl和MgSO4的配比對回收率的影響較大，但其具體影響原理和最佳配比規(guī)律需進一步探討。