鹽爪爪根際耐鹽促生菌的篩選及穴栽驗證

張志東, 顧美英, 唐琦勇, 楚敏, 朱靜, 孫建, 楊蓉, 徐萬里

(1.新疆農業科學院微生物應用研究所, 新疆特殊環境微生物實驗室, 烏魯木齊 830091;2.新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所, 烏魯木齊 830091)

新疆鹽堿土地分布廣，鹽堿化種類多樣，被稱為世界鹽堿土的博物館[1]。同時，由于長期耕作管理不當，以及當前膜下滴灌模式的采用，近50% 宜耕土地受不同程度鹽漬化和次生鹽漬化的威脅，嚴重影響了作物生長發育及產量。如何利用新技術、新方法有效減緩鹽漬化對農業作物的影響，推動新疆農業高效可持續發展，已成為科研工作者亟待解決的重大課題[2-3]。

植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobateria, PGPR)是指生存在植物根際或根表，直接或間接促進或調節植物生長的一類微生物菌群[4]。相關研究表明，根際細菌在共同適應和進化過程中，能夠通過多種機制促進植物生長，一方面可通過產生植物生長調節劑來直接促進作物生長，也可以通過其固氮、溶磷、解鉀的作用轉化土壤中礦物質，以促進植物相關營養元素的吸收利用[4-7]；另一方面，根際細菌也可通過產生抗菌物質、誘導作物產生系統抗性，以增強植物的抗逆特性[8-9]。同時，PGPR代謝活動能夠增強土壤中有機物的分解，促進植物營養元素的礦化，改良土壤結構和營養成分，提高土壤肥力[10-12]。國內外相關學者已對多種農作物如煙草、棉花、花生等開展植物根際促生細菌研究，結果表明，PGPR在農作物防病、增產中具有重要作用[12-15]。同時，在荒漠耐鹽植物根際耐鹽促生菌方面也有研究[13]，為利用相關菌株提高農作物耐鹽性、促生長、開發相關菌劑提供了理論依據。

新疆地區鹽生植物種類多、分布廣，其中藜科多年生灌木鹽爪爪[Kalidiumfoliatum(Pall.)Moq]是典型的鹽生植物，廣泛分布在鹽堿荒漠生境，具有較強抗逆特性。前期研究表明，鹽爪爪根際存在豐富的耐鹽微生物，部分菌株具有產生吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)和解磷等植物促生作用[14]。因此，進一步開展鹽爪爪根際微生物耐鹽促生菌的研究，將有利于相關微生物菌肥的研制，進而為新疆鹽漬土地的治理開發提供新技術和新方法。本研究以鹽爪爪根際微生物為研究對象，開展了其耐鹽促生細菌的分離鑒定及促生特性分析，并進行了棉花盆栽效果驗證試驗，旨在為進一步篩選和復配耐鹽促生菌肥提供科學依據和前期基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試植物 鹽爪爪于2016年4月采自新疆和碩地區。供試棉種為陸地棉新陸中42號，購自新疆明珠花卉市場。

1.1.2培養基 解磷基礎培養基(NBRIP培養基)、Ashby培養基、硅酸鹽細菌培養基、Pikovskaya’s培養基、TSA培養基等，均由青島高科技工業園海博生物技術有限公司生產。DF培養基、ADF培養基參照許芳芳[13]的方法配制。上述培養基在滅菌使用前，均另加2% NaCl。

1.2 試驗方法

1.2.1根際土壤的收集 鹽爪爪植株樣品采用垂直挖掘法，盡可能保證根部的完整性。選擇完整植株根部，采用抖落法去除非根際土壤，并在無菌條件下，利用無菌細毛刷輕刷根部，收集根際土壤樣品。土樣充分混合后轉移至無菌離心管中，于4 ℃環境保存備用[14]。

1.2.2PGPR菌株的分離 在超凈工作臺中稱取5 g鹽爪爪根際土樣，加入裝有50 mL 2% NaCl無菌溶液的三角瓶中。30 ℃、120 r·min-1振蕩 0.5 h，靜置10 min。吸取上述懸液1 mL，經適度梯度稀釋后，涂布至含有2% NaCl的分離培養基平板上，于30 ℃恒溫培養3～15 d，待菌落長出后，根據菌落的形態、大小、顏色等進行初步篩選，分離純化后，接至2% NaCl R2A培養基斜面上，4 ℃保存備用[14]。

1.2.3菌株的分子鑒定 使用菌落PCR法，采用細菌16S rDNA序列通用引物27 F和1 492 R擴增。PCR產物經切膠純化后，送往北京鼎國生物技術有限公司進行測序。所得序列經手工校對后，上傳至EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon/identify)數據庫進行比對，并調取相關同源性最高模式菌株序列, 使用MEGA 5.0進行CLUSTAL X多重比對[15]，并使用NJ(Neighbor-Joining)法構建系統發育樹，自舉值(Bootstrap)為1 000，初步確定菌株的生物學分類地位。

1.2.4菌株耐受性測定 選取各屬種代表性的14株菌株進行耐鹽促生實驗，菌株接種于含有2% NaCl的1/10 TSA液體培養基中，分別采用10和45 ℃恒溫培養，確定其低溫和高溫生長情況。菌株接種于含有10% NaCl的1/10 TSA培養基中，于 30 ℃恒溫培養3～15 d，連續觀察并進行耐鹽特性統計[14]。

1.2.5解磷和固氮能力測定 將14株代表性菌株點植到改良PKO 固體培養基上，30 ℃培養72 h，根據溶磷圈直徑與菌落直徑的比值大小初步判斷菌株溶磷能力的強弱。菌株的固氮特性以菌株在Ashby培養基上生長，初步確定為固氮陽性[13]。

1.2.6ACC脫氨酶陽性菌篩選 參考Penrose等[16]的方法，將14株代表性菌株接種至液體無氮培養基中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養24 h。吸取培養液0.1 mL 接種至5 mL DF液體培養基中，振蕩培養24 h。吸取上述培養液0.1 mL接種至ADF液體培養基中，振蕩培養48 h后，重復轉接ADF培養基中，能生長的菌株判定為ACC脫氨酶陽性菌株。

1.2.7IAA產生能力測定 將待測菌株接種含有2% NaCl的1/10 TSA液體培養基，于120 r·min-1、30 ℃ 恒溫震蕩培養5 d。取菌液，10 000 r·min-1離心15 min，每1 mL上清液加0.5 mL Salkowski 試劑。室溫暗處顯色1 h 后，于530 nm處測OD值[17]。以空白培養基作對照，并以IAA標準曲線計算發酵液中IAA濃度。

1.2.8棉花促生的穴盤驗證試驗 菌株通過相關促生定性定量分析后，選取12株代表性菌株進行盆栽驗證。采用4×5穴的穴栽盤，以水洗黃沙烘干后為穴栽土壤。土壤用5% NaCl溶液浸潤后，添加過夜放置自來水并混勻，最終使土壤含水量達到50%，含鹽量達到0.75%。選擇顆粒飽滿且無明顯破損的棉種，使用0.1%的升汞消毒5 min，無菌水洗凈后，浸于1/100濃度菌液4 h后，點植入穴栽盤，每穴為4粒，深度約1.5 cm，放置于人工氣候箱培養，光照強度24 000 lx，光照時間14 h·d-1，光照時溫度控制到30 ℃，無光照時溫度控制到25 ℃，濕度控制為40%。每種菌劑處理重復4穴，以在清水浸泡為對照1(CK1)，并以清水浸泡點植于無鹽土壤中為對照0(CK0)，每天用過夜放置自來水噴灑2次。待發芽后，每隔5 d澆灌一次(每穴約10 mL)。待發芽20 d后，測量各試驗組和對照組棉花植株的各種形態學參數，包括發芽率、株高、根長、干重等[18-19]。

1.3 數據處理

采用DPS 7.05軟件對數據進行統計分析，采用Office Excel 2003軟件繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 鹽爪爪PGPR菌株的分離與鑒定

2.1.1鹽爪爪PGPR菌株分離純化 培養3～15 d后，通過觀察菌落形態，共挑取各類菌株74株。通過進一步分離純化，菌落形態和顯微形態觀察去重后，共獲得試驗菌株57株。所得菌株保存至2% NaCl的R2A斜面上，用于進一步實驗分析。

2.1.2鹽爪爪PGPR菌株多樣性分析 由圖1可知，鹽爪爪根際PGPR菌株存在豐富的多樣性，所得菌株共歸屬在4個門12個屬。其中，放線菌門(Actinobacteria)所含菌屬最多，共涉及6個屬；其次為變形桿菌門(Proteobacteria)，涉及3個屬；再次為厚壁菌門(Firmicutes)，涉及2個屬；擬芽孢桿菌(Bacteroidetes)最少，僅涉及Sinomicrobium屬。

圖1 基于菌株16S rDNA序列的NJ進化樹

2.2 菌株耐鹽促生分析結果

表1顯示，經測試，86%的試驗菌株具有耐受10% NaCl的能力，50%的菌株具有產ACC脫氨酶能力，50%的菌株具有解無機磷能力，42.8%具有固氮能力，86%的菌株具有產IAA的能力。其中，菌株CM7產IAA能力最強，最高可達45.32 mg·L-1(圖2)，展現了鹽爪爪根際PGPR菌株在耐鹽促生中應用前景。

圖2 典型菌株產IAA的測定結果

表1 典型菌株耐鹽及促生特性分析結果

2.3 棉花穴栽盤驗證試驗結果

2.3.1菌株對棉花發芽率和干重的影響 從圖3可以看出，鹽分對棉花發芽率有明顯的抑制作用，與正常發芽率95%相比，試驗條件下未加菌液處理的棉種發芽率幾乎降低了一半，僅為50%左右，但對成活棉株的平均干重影響不明顯。多數試驗菌株處理可提高棉種在鹽脅迫下的發芽率，其中接種菌株R11提高最為明顯，發芽率達到75%，較未接種菌液處理發芽率最高可以提高25%；其次為菌株K18，其發芽率可以提高65%；其他菌株提高不明顯。而添加了MM18后，發芽率反而下降，僅為35%。干重數據顯示，以CK1處理的干重為基準，添加R11、K27、CM7等菌株處理后，棉株干重明顯提高，其中CM7處理最為明顯，干重較CK1處理提高了22.1%；而T25、K18等菌株處理對干重增加不明顯；菌株Y24處理后，棉株干重反而下降。

圖3 菌株處理對棉花發芽率和棉株干重的影響

2.3.2菌株處理對棉花株高和根長的影響 圖4顯示，試驗菌株處理可以有效提高棉苗根的生長，在出芽后3 d，與CK1比較，菌株處理后的棉苗根系生長即有明顯變化，其中R11、T25、K18等菌株處理后根系生長較好。進一步培養至20 d后，不同處理間根系差異更為明顯(圖5)，其中R11提高最為顯著，與CK1相比提高了135.2%。棉苗株高結果(圖6)也表明，菌株處理可以有效提高棉株生長，與CK1比較，R11、Y24、H9、T25、K18等菌株處理后，株高明顯提高，其中R11提高最為明顯，較CK1提高了46.1%。

圖4 典型菌株處理下棉花發芽3 d后的生長情況

注:不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有顯著性。

注:不同小寫字母表示差異在P<0.05水平具有顯著性。

3 討論

已有研究表明，PGPR可有效提高種子萌發率、促進根系生長、增加植物干重，特別是其定殖能力強，對根部的病原物具有抑制作用，是現代綠色農業、生態農業發展中化肥、農藥的理想替代品。目前，國內外相關學者已從多種植物根際分離到豐富多樣的根際，如芽孢桿菌屬[7,8,12]、假單胞菌屬[9,13,18]、腸桿菌屬[13-14]、土壤桿菌屬[14]、德氏菌屬[10,19]、克雷伯氏菌屬[19]、固氮菌屬[4,19]等菌株。本研究中，從鹽爪爪根際微生物中，分離到在4個門12個屬21個種，多數菌株具有根際促生作用，其中，如Isoptericola、Sinomicrobium等屬此前鮮有相關報道，也暗示鹽生植物中可能蘊藏著豐富的尚未開發利用根際促生微生物，有待進一步挖掘。

一般而言，高濃度鹽分對植物生長有不同程度的抑制作用，但鹽生植物在長期的適應和進化中，也形成了多種耐鹽機理，主要可分為泌鹽、拒鹽和稀鹽3種類型[20]。新疆素有世界鹽堿土博物館之稱，鹽堿種類多分布廣，耐鹽植物也多有分布。關于根際促生細菌提高植物耐鹽特性的機理主要包括誘導植物體內激素變化或自身產生相關植物激素，如IAA等，誘導植物產生滲透保護劑，產生胞外多糖減輕鹽脅迫，調控植物體內離子平衡等[13,18]。同時，部分菌株具有解磷解鉀、固氮等功能，也為植物生長提供了營養物質，以促進植物生長，減輕鹽脅迫對植株的影響。

鹽爪爪作為典型稀鹽植物，在鹽脅迫下，植株地上和地下部分積累 Na+的程度隨著土壤環境 NaCl濃度升高而增強。同時，鹽爪爪根際土壤中多種離子濃度顯著提高，鹽分積累可在根際形成“鹽島”效應。鹽爪爪根際存在豐富的微生物多樣性，且多數菌株呈現較高的耐鹽特性[14]。前期研究表明，鹽爪爪根際微生物群落活性總體呈現根際>根區>環境的趨勢[21]。本研究中，86%的試驗菌株具有耐受10% NaCl的能力，50%的菌株具有產ACC脫氨酶能力，50%的菌株具有解無機磷能力，42.8%具有固氮能力，86%的菌株具有產IAA的能力。一方面展現了鹽爪爪根際存在著豐富的耐鹽促生菌株，另一方面耐鹽促生菌株有可能參與了鹽爪爪耐鹽、聚鹽等生理特性，這有待進一步深入研究。

本研究采用耐鹽促生細菌處理棉種后，通過穴栽試驗證明了R11、T25、K18等菌株處理能有效提高棉花在鹽堿脅迫下的生長。其中，菌株R11處理后植株的株高和根長提高了135.2%和46.1%，這與趙雅峰等[22]的研究結果一致，也展現了菌株R11在棉花促生中良好前景。同時，采用菌株Y24處理后，盡管棉株的根系和株高增加了，但其干重反而下降，可能原因是Y24具有較強的促生長作用，由于穴載培養營養不足，加之種植時間短，過度的生長反而導致消耗能量比較多，不利于苗期植物干物質的增加，相關機理還需進一步驗證。此外，部分鹽爪爪根際促生菌對棉花生長的影響不明顯，甚至出現一定的抑制作用，這可能與相關菌株對棉花定殖效果差，或影響棉花根際正常菌群生長等有關，相關問題還有待進一步分析。同時，在進行棉花穴栽試驗時，采用水洗沙作為穴栽土壤，存在著澆水后隨著水分的蒸發，鹽分向上聚積的情況，可能造成植株所受的鹽分脅迫大于采用松軟基質。同時，也存在水洗沙營養不足等情況，導致部分菌株處理后植株發芽率和干重增加不明顯，上述問題還將有待進一步驗證。