Argonaute蛋白在植物逆境脅迫響應中的功能

蒲偉軍, 譚冰蘭, 朱莉

(中國農業科學院生物技術研究所， 北京 100081)

Argonaute (AGO)蛋白是一類RNA結合蛋白，在sRNA介導的基因沉默中起關鍵作用。其在轉錄及轉錄后水平參與基因表達的調控，維持基因組完整性。作為RNA 誘導沉默復合體(RNA-induced silencing complex, RISC)的核心蛋白，AGO蛋白是表觀遺傳調控的主要參與者,在RNAi 中通過剪切靶向mRNA、翻譯抑制、DNA 甲基化等方式發揮作用[1]。近年來，有關植物中AGO 蛋白的研究日益增多，主要集中在AGO 蛋白的生物學功能及其結合的sRNA 類型等方面。不同類型sRNA 結合特定的AGO蛋白，在植物生長發育和逆境脅迫響應中發揮重要作用。本文綜述了AGO 蛋白的結構特征、分類、作用模式及其在植物逆境響應中的生物學功能，旨在為今后深入研究植物AGO功能提供理論基礎。

1 植物Argonaute蛋白結構特點和分類

AGO蛋白在擬南芥突變體ago1中首次被發現，因突變株形狀如“八爪魚”，故命名為Argonaute[2]。該蛋白普遍存在于生物有機體中，相對分子質量較大(約為105)、家族成員龐大，是sRNA介導的沉默復合體(RISC)的核心元件。AGO蛋白屬于多結構域蛋白，由可變N端、PAZ(PIWI Argonaut and Zwille)、MID和PIWI(P-element induced wimpy testis)等結構域組成(圖1)。其中，PAZ結構域是sRNA的結合位點，識別并結合sRNA突出的2 nt的3’-端；MID形成像“口袋”一樣的結構，結合sRNA 5′-磷酸端，將sRNA 錨定在AGO蛋白上；PIWI結構域具有內切酶的活性，能夠切割并降解靶mRNA，PIWI內存在保守的活性位點Asp-Asp-His (DDH motif)，可能與其催化活性有關[1]。此外，在AGO蛋白結構中還發現存在其他較為保守的基序(motif)如ArgoL1(argonaute linker 1)、ArgoL2(argonaute linker 2)以及Gly-rich_Ago1(glycine-rich region of Ago1)等，這些基序在不同AGO蛋白中的位置、有無及功能間存在差異。有研究表明，SiAGO1b的C端基序是調控谷子生長發育和應激反應所必需的[3]。

注：Gly-rich—富含甘氨酸的區域；ArgoN—N末端結構域; L1—連接肽1結構域；PAZ—PAZ結構域；L2—連接肽2結構域；Mid—中間結構域；PIWI—PIWI結構域; ◆—預測活性位點。Note: Gly-rich—Glycine-rich region; ArgoN—N-terminal domain; L1—Argonaute linker 1 domain；PAZ—PAZ domain；L2—Argonaute linker 2 domain； Mid—Mid domain of argonaute；PIWI—PIWI domain; ◆—Predicted active site.圖1 Argonaute蛋白結構Fig.1 Structure of Argonaute protein

目前，除了釀酒酵母外，AGO蛋白在所有真核生物、細菌和古細菌中均存在，是一類數目龐大的家族。編碼AGO蛋白的基因在不同物種中差異很大，從粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)中的1個到秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的27個[1]。目前，已經在18個植物物種中鑒定到不同數量的AGO家族成員，其中，黃瓜(Cucumissativus)中數量最少，只有7個，擬南芥 (Arabidopsisthaliana)中有10個，油菜(Brassicanapus)中最多，有27個， 表明植物中AGO家族成員的數量在物種間存在差異[4-6]。

根據系統進化以及AGO蛋白結合的sRNA 類型可將AGO家族分為3 個亞族，即AGO-like、PIWI-like 和Group 3，目前植物中發現的AGO蛋白均屬于AGO-like亞家族[7]。從系統發育的角度又將這些蛋白分成3個主要的亞類：AGO1/5/10、AGO2/3/7和AGO4/6/8/9[8]。其中，AGO18b是禾本科植物所特有的，在花序分生組織發育和病毒防御方面發揮著重要作用[9-10]。

2 植物AGO蛋白作用模式

由于植物AGO基因序列在進化過程中發生大量重復和缺失，導致該家族不斷擴大，功能呈現多樣化[7]。AGO蛋白的功能多樣化很有可能與內源性sRNA介導的RNA沉默通路的特化和進化過程有關。植物AGOs與sRNA的關聯主要是基于sRNA的5’-核苷酸序列和/或sRNA雙鏈和AGO蛋白PIWI結構域的序列和結構特征。植物AGO-sRNA復合物可通過不同的方式沉默與之互補的DNA或RNA，發揮其生物學作用。不同AGO蛋白和特定sRNA之間的互作可將植物RNAi通路分為轉錄基因沉默(transcriptional gene silencing, TGS)和轉錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)。其中，AGO4/6/9主要參與TGS, 而AGO1/2/3/5/7/10則主要參與PTGS[11-12]。

植物AGOs的作用模式可歸納為七種(圖1)[1]：① 核苷酸內切。AGO蛋白的PIWI結構域可利用內源性類RNAse H活性來切割靶向RNA。現已發現幾種，如擬南芥 AGO1、AGO2、AGO4、AGO7和AGO10均可結合sRNAs并切割與之序列高度互補的靶標RNA，切割產物被內源性降解途徑的組分降解。此外，植物AGOs的切割活性也是觸發某些目標轉錄本中phasiRNAs(phased small-interfering RNAs)擴增的必要條件。② 翻譯抑制。擬南芥AGO1和AGO10等與miRNA結合，并以序列高度互補的RNA為靶點，抑制其翻譯。近期研究表明，AGO7-miR390如結合到TAS3a非編碼轉錄本中的一個不可切割的miR390靶位點，會導致核糖體堆積，進而抑制翻譯延伸。然而，通過結合AGO-miRNA復合體來直接阻斷核糖體運行，這種由植物miRNA介導的翻譯抑制的貢獻似乎有限。③ 典型RdDM(RNA-directed DNA methylation)途徑。DNA甲基化可調控基因表達，阻斷轉座子發生轉座，從而維持基因組的完整性。在植物中，典型的DNA甲基化主要是在AGO4-siRNA復合物介導的依賴于RNA的RdDM途徑中發揮作用。④ miRNA螯合。研究發現，擬南芥AGO10、水稻AGO18可分別螯合來自AGO1的miR165/166、miR168和miR528，進而調控莖尖分生組織發育和防御病毒。⑤ 雙鏈斷裂修復(DSB)。擬南芥AGO2與DSB誘導的siRNAs(diRNAs)結合，介導DSB修復。⑥ siRNA生成不依賴于DCL(dicer-like)蛋白。DCL是siRNA產生的關鍵因素，而AGO4可以與初生的Pol II RNA結合，再經由3’-5’外切酶剪切產生siRNAs，該過程不需要DCL蛋白的參與。⑦miRNA基因表達的協同轉錄調控。在鹽脅迫下，AGO4指導新生miR161或miR173前體的切割，以協同轉錄方式調控miRNA的產生。隨著研究的不斷深入，將進一步發掘出AGO蛋白新的作用模式。

注：①核苷酸內切；②翻譯抑制；③經典RdDM途徑；④ microRNA螯合；⑤雙鏈斷裂修復(DSB)；⑥不依賴DCL的siRNA生物發生；⑦ miRNA基因表達的協同轉錄調控。Note: ① Endonucleolytic cleavage; ② Translational repression; ③ Canonical RdDM pathway; ④ MiRNA sequestration; ⑤ Double-stranded break repair (DSB); ⑥ DCL-independent siRNA biogenesis; ⑦ Cotranscriptional regulation of miRNA gene expression.圖2 植物AGO蛋白的作用模式[1]Fig.2 Modes of action of plant AGO protein[1]

3 AGO蛋白在植物逆境脅迫響應中的功能

近年來，有關AGO蛋白在植物逆境脅迫響應中的功能一直是研究熱點之一。病蟲害、極端溫度、鹽堿、干旱和營養缺乏等逆境脅迫是限制植物地理分布和作物產量的主要因素。為了減少這些逆境脅迫的不利影響，植物已經進化出了特定的機制得以生存。其中,microRNA (miRNA)介導的基因表達調控是植物應對生物和非生物脅迫的重要機制之一[13]。而AGO蛋白作為RISC的核心元件，是miRNA功能通路的關鍵組分，不僅參與植物生長發育的調控，還參與調控植物逆境脅迫的應答。植物AGO蛋白的生物學作用簡要歸納如表1所示。

表1 植物AGO蛋白的生物學功能Table 1 Biological functions of plant AGO proteins

3.1 AGO蛋白在植物響應生物脅迫中的生物學功能

自然界中各種生物和非生物逆境脅迫對植物生長、發育和產量產生不同程度的影響。生物脅迫是指對植物生存與發育不利的各種生物因素的總稱，通常是由感染和競爭所引起的，如病害、蟲害、雜草危害等。已有研究表明，AGO蛋白在植物對生物脅迫的響應中發揮重要作用。

3.1.1防御病毒 病原微生物可導致作物的產量和品質受到嚴重的損失，植物會通過各種途徑來抵御病毒侵染等逆境脅迫，近年來研究表明，AGO蛋白在植物防御病毒過程中扮演著重要角色[14-21]。至今已發現植物中有很多AGO蛋白具有病毒防御功能，如擬南芥AtAGO1/2/3/4/5/7/10[14-16]，煙草NbAGO1/2/4/10[17-20]以及水稻OsAGO1/18[21]。然而，不同AGO蛋白在病毒防御中所發揮的作用不同，如AGO1主要參與miRNA介導的基因沉默和轉錄后基因沉默[12]；AGO2主要參與miRNA介導的基因沉默、翻譯抑制，并在免疫應答中發揮作用[54]；AGO4主要通過結合24 nt siRNAs形成RNA介導的DNA甲基化復合物(RdDM)，參與DNA甲基化和轉錄基因沉默[47, 50]；AGO5可結合21～24 nt siRNAs，參與轉錄后基因沉默和系統抗性[55]。

不同的病毒侵染會誘發宿主植物產生不同的對抗機制，AGO蛋白在植物病毒防御機制中可能通過結合病毒產生的siRNA來抑制病毒自身RNA的表達。vsiRNA(virus-derived small interfering RNAs)是病毒來源的RNA 或dsRNA被植物DCL(dicer-like)加工成的21～24 nt siRNA，與AGO蛋白特異性結合后，通過剪切或翻譯抑制等方式靶向和抑制同源病毒RNA，從而增強病毒防御能力[56]。AGO蛋白也可能通過調控防御基因的表達來間接影響病毒的復制，如水稻植株受到RSV(rice stripe virus)侵染后，OsAGO18基因被誘導性表達，分別通過競爭性結合miR168和miR528解除OsAGO1的負調控和釋放miR528對AO(抗壞血酸氧化酶)的負調控，AO 通過氧化抗壞血酸調節植物體內的氧化還原穩態，促進植物體內活性氧(ROS) 的積累，從而達到病毒防御的效果[57]。在煙草中發現，AGO4 蛋白對病毒轉錄本翻譯的調控可能是R基因(NB-LRR) 介導的抗病毒機制中的一個關鍵因素[58]。此外，AGO蛋白還有可能通過調控其他AGO蛋白的功能來影響其抗病毒防御功能，如AGO1 和AGO2以非冗余和合作的方式抵御病毒侵染[59]，而擬南芥DRB4、AGO1、AGO7和RDR6共同參與DCL4啟動的被DCL1負調控的抗病毒RNA沉默通路[60]。以上研究表明植物抗病毒防御網絡的復雜與多樣性。

3.1.2防御細菌 AGO蛋白在植物抵御細菌侵染方面具有重要作用，如AGO1依賴型的miRNA正調控PAMP(pathogen-associated molecular pattern)誘導的胼胝質沉積和細菌抗性。細菌鞭毛蛋白來源的多肽flg22可觸發AGO1結合，促進先天免疫系統和幾丁質應答基因的轉錄[29]。衍生肽誘導的miRNAs (miR393)可通過兩種不同的AGOs蛋白在抗菌免疫中發揮作用。其中與AGO1相關的miR393和與AGO2相關的miR393*分別與PTI(PAMP-triggered immunity)和ETI(effector-triggered immunity)有關[61]。番茄細菌性葉斑病是由Pseudomonassyringaepv.tomato引起的一種世界范圍內廣泛發生的植物細菌性病害, AGO4作為RdDM通路的重要組成部分，在調節植物病原細菌DC3000抗性中發揮獨特功能。若RdDM通路組分的功能缺失，會導致AGO4的上游或下游都不利于對P.syringae的抗性。因此，在細菌感染后，AGO4下調表達，抑制RdDM通路，進而抑制轉錄基因沉默(TGS)[62]。以上研究表明，RNAi機制是植物抵御各種病原菌的一種常見的內源性防御機制，其中AGO蛋白作為重要核心元件發揮著重要的作用。

3.1.3防御病原真菌 除了在病毒防御方面的功能外，植物和植物真菌病原體具有相似的RNAi機制，一方面被宿主用來防御病原體，另一方面被入侵生物利用來生長、發育和致病。真菌DCLs產生sRNAs，通過與植物AGO1蛋白結合，劫持RNAi機制，沉默宿主免疫系統[63]。研究發現，植物RNAi組分在不同寄主植物中的直接參與和差異表達對真菌病原的影響存在矛盾。擬南芥突變體dcl4、ago1、ago2、ago7、ago9等對大麗輪枝菌(VerticilliumdahliaKleb.)、菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和疫霉菌(Phytophthoraspecies)感染更敏感，表現出增強的癥狀[6]。而油菜(Brassicanapus)AGO1蛋白的敲除則增強了對大麗輪枝菌(V.dahlia)和長孢黃萎病菌(Verticilliumlongisporum)的抗性[24]。VmAGO2是蘋果腐爛病菌(Valsamali)致病力的關鍵因素，可導致蘋果葉片和嫩枝患病[64]。最新研究發現，NaAGO4可通過調節茉莉酸信號途徑調節對短枝鐮刀菌(Fusariumbrachygibbosum)的抗性[26]。下一步的研究需要了解RNAi通路各組分的確切機制和協同策略，有望解決植物對各種病原體的復雜的防御系統。

3.1.4防御害蟲AtAGO8在擬南芥所有組織中表達量均較低，曾被認為是一個假基因，然而，在煙草中研究發現，NaAGO8基因沉默的煙草會使煙草天蛾生長加快，NaAGO8蛋白是通過結合的sRNA 調控MYB轉錄因子的表達，進一步調節尼古丁、芬妥胺類和二萜苷類物質的合成與代謝途徑來誘導抗性響應。此外，NaAGO8基因沉默還會影響植物激素(例如JA和ABA) 的信號轉導，表明NaAGO8可通過調節草食動物反應中防御信號網絡的幾個調控節點，在誘導直接防御中發揮核心作用[27]。近期也有研究發現，小麥TaAGO5在調節對麥雙尾蚜(Diuraphisnoxia)侵染的反應中至關重要。在麥雙尾蚜抗性小麥中，TaAGO5基因被敲除22%導致完全敏感，表明TaAGO5在小麥蚜蟲取食過程中防御反應很關鍵，同時還發現，TaAGO5可能在小麥病毒侵染過程中發揮作用。眾所周知，AGO5蛋白主要是在雙子葉植物對節肢動物草食和病毒感染的反應中發揮作用，而TaAGO5的這一作用可能在小麥等單子葉植物中也是保守的[28]。

3.2 AGO蛋白在植物響應非生物逆境脅迫中的生物學功能

已有研究表明，植物中不同AGO基因在不同逆境脅迫下(冷、熱、激素、鹽、干旱等)呈現出不同程度的表達差異，但其表達模式既具有保守性，也具有物種的特異性，并且每種AGO蛋白所發揮的功能也不盡相同[4, 65-66]。

AGO1是目前AGO蛋白家族研究中所發現的參與通路最多、功能最豐富的一類，研究表明，AGO1蛋白主要通過sRNAs-AGO1-miRNAs所形成的調控網絡在植物生長發育、逆境脅迫響應等生物學過程中發揮重要的調控作用[29, 67]。AGO1功能缺失通常會導致植株表現出矮稈、窄葉、花序不育、葉片早衰、結實率低等發育異常表型[3]。AGO1在調控miRNA介導的耐旱機制方面起著關鍵性作用[67-68]。在ABA和干旱處理下，擬南芥中AGO1轉錄活性增加，在脅迫反應期間，miR168a轉錄水平的升高是維持穩定的AGO1轉錄水平所必需的。表明miR168a的轉錄調控和AGO1穩態的轉錄后調控在植物響應非生物脅迫和信號轉導中發揮重要而保守的作用[67]。進一步研究發現，擬南芥中AGO1功能缺失不僅促進葉片氣孔關閉，從而導致耐旱性提高，而且可改變擬南芥對ABA和其他非生物脅迫的響應，表明AGO1可能是擬南芥ABA信號通路和脅迫響應的負調控因子[68]。小RNA測序和降解組分析表明，miRNA及其特異性靶標包括miRNA效應蛋白AGO1、干旱信號相關受體和酶、轉錄因子以及其它結構和功能蛋白在茶樹抗旱反應中發揮重要作用[69]。NAC轉錄因子衍生的階段性小干擾RNA (phased secondary small interfering RNA，phasiRNA)受miR1514a調控，AGO1通過與phasiRNA結合在豆科植物干旱脅迫響應中發揮功能[70]。近年來研究發現，AGO1不僅作為RNA結合蛋白，還作為DNA結合蛋白，在植物響應激素和逆境脅迫過程中結合染色質并促進茉莉酸等信號通路的基因表達，表明AGO1在植物響應不同內外源信號過程中具有異于經典RNA干擾而激活基因表達的調控功能[29]。AGO蛋白的穩定性是其行使生物學功能的前提，有研究發現，重金屬銫Cs毒性可破壞miRNAs前體的加工過程和AGO1蛋白的穩定性，影響miRNA和AGO1蛋白介導的基因沉默，進而導致發育紊亂[71]。

AGO2可以通過結合多種miRNA靶區(ORF, 3’-UTR)行使其催化裂解活性、翻譯抑制潛能和抗逆境活性[1]。當細胞響應逆境脅迫時，AGO2與mRNA的相互作用會發生重構，并與翻譯效率的改變相關[54]。RNA誘導的沉默復合體RISCs(RNA-induced silencing complexes)可能通過競爭性結合介導RNA干擾，阻止AGO2的募集而抑制應激顆粒(stress granule)的形成，表明AGO2在響應逆境脅迫中具有重要的調控作用[72]。

RNA介導的DNA甲基化(RdDM)途徑在調控生物和非生物的應激反應方面發揮重要作用。研究發現，AGO4、AGO6可以通過RdDM途徑參與基因和轉座子的轉錄沉默[50]。通過對擬南芥中AGO4相關的長鏈非編碼RNA(lncRNAs)的分析發現，AGO4可能通過RdDM引導基因核染色質修飾、阻止隱性轉錄而維持或激活脅迫響應相關基因的表達，表明植物AGO蛋白在RdDM調控植物響應逆境脅迫過程中起著非常重要的作用[51]。

AGO5通過與擬南芥miR156的互作可抑制衰老誘導的開花過程。研究發現，AGO5可通過光照、環境因素等調控SPL(SQUAMOSA-PROMOTER BINDING LIKE)轉錄因子的表達進而調控開花時間。AGO5主要是在分生組織(而非營養器官)中介導了miR156的活性，表明miR156衰老途徑的時空調控是通過不同組織中不同的AGO蛋白介導的[43]。

種子休眠期短是導致種子在穗收獲前萌發的最重要的方面，受各種環境因素的影響，包括光、溫度等。研究表明，作為RdDM途徑關鍵因子，AGO4_9類蛋白可能參與調控植物種子休眠和萌發的生物學過程，AGO802-B可能通過調節DNA甲基化在種子休眠和收獲前萌發(pre-harvest sprouting，PHS)抗性方面發揮作用[73]。以上研究表明，不同AGO蛋白在響應逆境脅迫中其表達模式及生物學功能存在差異。

此外，在同一逆境脅迫下，不同AGO蛋白響應特點及作用機制會有所不同。比如在鹽脅迫下AGO1可通過協同轉錄調控細胞核中miR161和miR173的表達來做出響應[12]。而AtAGO2對鹽脅迫的調控作用則依賴于一個RNA結合蛋白MUG13.4，并在轉錄水平通過影響SOS級聯信號傳遞途徑，提高擬南芥對鹽脅迫的耐受性[30]。環型泛素連接酶McCPN1在鹽生植物中可催化UBC8依賴性蛋白泛素化并與AGO4相互作用。在鹽脅迫下，McCPN1可能參與了AGO4的催化降解[74]。在鹽脅迫條件下LBD12-1轉錄因子通過抑制AGO10的表達來控制根尖分生組織的大小[44]。

以上研究表明，應對不同逆境脅迫，不同的AGO基因表述模式和響應機制有所不同。這些結果為進一步研究AGO蛋白在植物逆境響應中的作用提供了依據。

3.3 輔助AGO作用的蛋白

植物的抗逆性是由多基因控制的復雜性狀，涉及到生物個體生長發育的維持、滲透及離子吸收的調節和平衡適應、信號轉導和代謝等諸多方面，相關基因之間相互作用使植物的抗逆性得以表現。比如豌豆P68 蛋白(Pisumsativump68，PSP68) 作為非生物氧化和應激反應通路的分子開關，通過與AGO1 蛋白相互作用，可改善作物對逆境的耐受性[75]。原則上，植物AGO蛋白通常需要輔助因子來發揮它們的功能，比如AGO蛋白需要熱休克蛋白(Hsp70-Hsp90)來陪伴和水解ATP以完成加載過程和構象變化[76]。然而，迄今為止被鑒定到與植物AGO蛋白相互作用的蛋白質數量有限。目前已知的植物AGO互作蛋白主要有CYP40、HSP90和TRN1，它們與AGO1相互作用在逆境脅迫響應中發揮功能[1, 77]。近期研究，發現擬南芥中一種核定位的內在紊亂蛋白，名為CARP9蛋白(CONSTITUTIVE ALTERATIONS IN THE SMALL RNAS PATHWAYS9)，在細胞核中連接HYL1(HYPONASTIC LEAVES1)和AGO1以促進sRNA活性[78]。其他與AGO互作蛋白還有待于進一步發掘、鑒定。

4 結語

近年來，在擬南芥、水稻、煙草等模式作物中有關AGO蛋白家族的結構和功能研究廣泛且系統，表明其作為RNA誘導沉默復合體的核心元件，不同家族成員之間的功能既相互聯系又相對獨立，在植物生長發育和逆境脅迫響應中發揮重要作用。然而目前在植物AGO蛋白研究領域中仍存在如下幾個問題：一是AGO蛋白靶標RNA還有待進一步探索；二是AGO蛋白轉錄調控因子在很大程度上未知；三是AGO蛋白在植物生長發育和逆境響應中的生物學功能及作用機制尚不明確，尤其是在非生物脅迫方面的功能研究相對較少。AGO蛋白的未知新功能值得進一步探索。

未來需要解析AGO蛋白發揮生物學功能的上游調控途徑以及互作因子，即不同AGO蛋白在哪些miRNA/siRNA發揮功能時起作用，AGO 蛋白對sRNA的選擇機制有待進一步揭示；這些miRNA/siRNA的靶標基因是什么，靶標基因又如何調控AGO蛋白在植物逆境脅迫響應中的作用，以進一步深入解析不同逆境脅迫條件下不同AGO蛋白發揮的具體功能及其作用機制。