PoprL啟動子對丁香假單胞菌DC3000合成冠菌素的影響

何彥, 姜峰, 于莎, 于春欣, 譚偉明, 李召虎, 張杰, 段留生*

(1.中國農業大學農學院， 植物生理生化國家重點實驗室， 教育部植物生長調節劑工程研究中心， 北京 100193； 2.中國農業大學園藝學院， 北京 100193；3.中國農業科學院植物保護研究所， 植物病蟲害生物學國家重點實驗室， 北京 100193)

冠菌素(coronatine，COR)是由丁香假單胞菌等幾個致病變種產生的次生代謝產物，是一種具有生物活性的天然化合物[1]。COR化學結構由冠菌酸(coronafacic acid, CFA)和冠烷酸(coronamic acid, CMA)兩部分組成[2]。在丁香假單胞菌DC3000中，生物合成CMA和CFA是獨立的：CMA的生物合成來源于L-異亮氨酸，由CmaA的非核糖體肽合成酶腺苷酸結構域激活；CFA由環戊酮化合物合成，隨后由CFA操縱子基因進行修飾；冠狀連接酶cfl是CFA操縱子內九個開放閱讀框之一，它以酰胺鍵連接CFA和CMA，形成COR[3-4]。研究表明，COR廣泛參與植物的生理和生化過程，包括乙烯釋放、花青素產生、生長素合成和生物堿積累[5-8]。低濃度COR可以增強植物的抗逆性，包括棉花耐鹽性[9]、大豆和花椰菜抗旱性[10-11]、小麥熱逆性[12]和黃瓜耐冷性[13]。由于能夠調節植物生長、發育和對脅迫的反應，COR及其衍生物被認為是農業化學應用中有潛力的目標化合物，包括開發新型除草劑[14-15]。

啟動子在基因的轉錄和表達調控中具有極其重要的作用，是核酸序列分子上RNA聚合酶和轉錄調節因子等識別并結合從而形成轉錄起始復合物的區域。目前，常見的啟動子轉錄模式為3種：組成型表達啟動子、組織/器官特異性表達啟動子和誘導型表達啟動子[16]。組成型啟動子在不同的培養條件下強弱穩定；誘導型啟動子則在特定的培養條件下啟動基因表達[17]。在代謝工程中，常常需要表達外源基因或者調控內源基因表達來影響代謝產物的合成，因此啟動子的選擇對基因的表達調控至關重要，它能夠影響基因的轉錄水平，影響人工合成途徑或本源途徑中各基因間的協調性，繼而影響菌株的代謝功能和產物[18]。

研究表明，利用高效表達型啟動子可以提高微生物中代謝產物的產量。王欣然[19]在鏈霉菌中利用高效啟動子5063p與格爾登素PKS啟動子置換，對PKS基因進行定向過表達，發酵代謝產物格爾登素的產量提高了39%。在菌株M.echinosporaz中啟動子PermE*通過同源重組替換，表達具有催化慶大霉素合成功能的基因kanJ和kanK，代謝產物慶大霉素的產量由85 μg·mL-1提高到了342 μg·mL-1[20]。在釀酒酵母中，通過啟動子改造等方法，得到了不同程度產D-乳酸的工程菌株，最高產量達到了5.8 g·L-1[21]。在冠菌素異源表達菌株PseudomonasputidaKT2440中，采用依賴于σ70的組成型啟動子PrpsH替換原始啟動子可使冠菌素合成的前體物質冠菌酸(CFA)產量提高10倍[22]。cfl基因在DC3000中的轉錄活性遠遠低于PG4180，相對應的冠菌素產量在PG4180中更高，在PG4180中冠菌素產量是DC3000冠菌素產量的25～40倍。此外，cfl的轉錄水平也受溫度的影響，在18 ℃時的轉錄活性高于28 ℃時的轉錄活性。這些結果表明，cfl基因啟動子的活性會影響冠菌素的生物合成[23-24]。

啟動子PoprL來自于惡臭假單胞菌肽聚糖相關脂蛋白(peptidoglycan-associated lipoprotein)編碼基因oprL，研究表明，oprL基因啟動子-35區和-10區很保守，與σ70識別的啟動子具有很高的相似性，用該啟動子在大腸桿菌中表達β-半乳糖苷酶，表達效率很高[25]。為了提高丁香假單胞菌DC3000冠菌素產量，改善高溫發酵培養條件對菌株冠菌素產量的制約影響，本研究將高效表達組成型啟動子PoprL同源重組到丁香假單胞菌DC3000冠菌素合成基因cfl中，研究啟動子PoprL對冠菌素生物合成產量和發酵培養條件的影響，所得研究結果不僅為冠菌素高產工程菌的構建和發酵條件的優化提供新的思路和參考，而且也為冠菌素的工業化生產應用提供更多的選擇和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1菌株和質粒 研究中出發菌株為丁香假單胞菌番茄致病變種Pseudomonassyingaepv.tomatoDC3000，該菌株為產COR野生型菌株，具有Amp和Rif抗性；菌株PseudomonasputidaAB92019，含PoprL啟動子野生型菌株，具有Cb抗性；質粒pUCP24/recTE，含有recTE基因重組質粒載體，具有Gen抗性；質粒pKD4，含卡那抗性基因載體，均由本實驗室保存。

1.1.2培養基 菌株培養基為LB培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，用蒸餾水溶解后定容至1.0 L，并調節pH 7.2左右。

種子液培養基為MG培養基：甘露醇10.0 g，L-谷氨酸鈉2.0 g，KH2PO40.5 g， NaCl 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，用蒸餾水溶解后定容至1.0 L，調節pH至7.0。

發酵培養基：NH4Cl 1.0 g、K2HPO43.6 g、KH2PO44.1 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、KNO30.3 g，用890 mL蒸餾水溶解后調節pH至6.8，121 ℃滅菌30 min，接種前加入單獨滅菌的2 mmol·L-1FeCl310 mL，過濾除菌的20%(質量體積分數)葡萄糖溶液100 mL。

菌株轉化子的篩選和重組菌株的培養所使用抗生素的終濃度為：卡那霉素(Kanamycin, Kan)50 μg·mL-1；慶大霉素(Gentamicin, Gen)10 μg·mL-1。

固體培養基的配制為在上述培養基中加入1.5%(質量體積分數)的瓊脂粉。

擬南芥種子培養基：1/2 MS培養基、0.8%(質量體積分數)瓊脂粉、1%(質量體積分數)蔗糖，pH 5.8～6.0，滅菌備用。

1.1.3主要試劑 PCR所用試劑、DNA Marker均購自大連TaKaRa公司，PCR引物由上海生工生物工程公司合成，細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)和質粒提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)。RNA提取試劑盒和RT-qPCR試劑盒均購于康為世紀公司。冠菌素標準品購自Sigma 試劑公司(美國)，色譜甲醇購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司，石油醚、乙酸乙酯均購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1啟動子重組菌株的構建 挑取菌株PseudomonasputidaAB92019和PstDC3000單菌落于LB培養基，28 ℃，180 r·min-1搖床培養12 h以上，利用天根細菌基因組試劑盒提取PseudomonasputidaAB92019和丁香假單胞菌PstDC3000 總DNA。利用同源重組方法[26]構建重組菌株，以葉婷[27]報道的PoprL啟動子引物序列，并結合NCBI上PstDC3000基因組序列信息設計SOE-PCR融合基因引物(表1)。以PseudomonasputidaAB92019基因組DNA為模板，引物CO1/CO2擴增PoprL啟動子片段，反應程序為：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性15 s，56 ℃ 退火45 s，72 ℃延伸30 s，30個循環。回收362 bp目的片段；以pKD4質粒為模板，引物CO3/CO4擴增卡那抗性基因，反應程序中PCR退火溫度57 ℃ 45 s，延伸時間1 min，30個循環，回收795 bp目的片段。采用SOE-PCR方法進行PoprL啟動子片段與卡那基因融合，PCR擴增分為兩步：第一步將上述回收的兩個目的片段既為模板又為引物進行PCR擴增，退火溫度58 ℃ 3 min，延伸時間90 s，13個循環；再以此次PCR產物為模板，引物CO1/CO4進行第二步PCR擴增，退火溫度58℃ 45 s，延伸時間90 s，30個循環，回收得到1 157 bp融合片段。按照上述同樣的方法進行cfl基因啟動子上游同源臂片段532 bp(引物CO5/CO6)和cfl基因啟動子下游同源臂片段532 bp(引物CO7/CO8)擴增與融合，最終回收得到 2 221 bp融合目的片段。將質粒pUCP24/recTE電擊轉化到PstDC3000感受態中。轉化條件：脈沖場強V為12.5 kV·cm-1, 電容C為25 μF，阻抗R為200 Ω，脈沖時間G為4 ms。Gen抗性篩選轉化子得到含有pUCP24/recTE重組質粒的PstDC3000菌株，再將回收得到的2 221 bp融合目的片段電擊轉化到含有pUCP24/recTE重組質粒的DC3000菌株中，Kan抗性篩選轉化子，PCR擴增鑒定，擎科公司測序驗證。

1.2.2冠菌素的提取和檢測 出發菌株PstDC3000與重組菌株MG固體培養基平板劃線，培養箱28 ℃培養。挑選出發菌株PstDC3000與重組菌株單菌落至MG液體培養基，培養至種子液OD600達到1.0，將種子液接種至發酵培養基中，接種量為2%(體積分數)，分別于18和28 ℃，180 r·min-1搖床培養10 d取樣。取1.5 mL發酵液于2 mL離心管中，調節pH 至2.5～2.9，8 000 r·min-1離心10 min，取上清1.0 mL于新離心管中，加入1.0 mL石油醚，震蕩20 s 后，靜置2 min，移除上層有機相后加入1.0 mL乙酸乙酯，震蕩萃取20 s后靜置2 min，將乙酸乙酯相轉移至新離心管中，重復萃取3次，自然風干或氮氣吹干后溶于1.0 mL 甲醇即為待測樣品，用于冠菌素含量檢測[28]。冠菌素含量采用高效液相色譜法測定，高效液相色譜流動相由甲醇和水(含0.5%的乙酸)按6.5∶3.5比例配成，檢測波長為220 nm，流動速度為1 mL·min-1，進樣量為20 μL，樣品保留時間為30 min，并通過與冠菌素標準品峰面積比較確定冠菌素的含量。

1.2.3致病性檢測 選取同一生長時期的擬南芥野生型Col-0分別接種PstDC3000和基因重組菌(菌液OD600≈0.01)，22 ℃、16 h光照培養，19 ℃、8 h 黑暗培養。使用1 mL去針頭的注射器從擬南芥葉片背面分別注入PstDC3000和基因重組菌菌液，同時將注射等量MgCl2溶液的擬南芥葉片作為對照，72 h后觀察發病情況。

1.2.4RNA提取和qRT-PCR實驗PstDC3000和基因重組菌分別接入發酵培養基，分別于18 和28 ℃，180 r·min-1搖床培養24和 48 h后收集菌體，按照康為世紀 RNA pure Bacteria Kit說明書提取RNA，用Takara公司試劑 DNaseⅠ消化處理，并按照Takara PrimeScriptTMⅡ1st strand cDNA Synthesis Kit說明書進行cDNA合成，用SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)試劑進行qRT-PCR試驗，所用引物見表1。反應體系為15 μL：SYBR?Premix ExTaqTM II(2×)7.5 μL，PCR Forward Primer(10 μmol·L-1)0.3 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol·L-1)0.3 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.3 μL，稀釋10 倍的cDNA 模板1.5 μL，ddH2O 5.1 μL。反應程序：95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40 個循環； 95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s。

2 結果與分析

2.1 啟動子基因重組菌株的獲得

以PseudomonasputidaAB92019總DNA為模板，用引物CO1和CO2進行PCR擴增，獲得大小為362 bp的 PoprL啟動子片段。基于基因同源重組原理對cfl基因啟動子區域進行替換，篩選到具有卡那霉素抗性的突變菌株，利用cfl基因啟動子上、下游同源臂兩端位置引物CO5和CO8，對突變菌株目的片段進行PCR擴增驗證，預期擴增片段大小為2 221 bp，將目的條帶回收測序，基因序列正確，說明成功構建了含有PoprL啟動子的重組菌株，命名為CO。

2.2 基因重組菌株生長及其冠菌素產量情況

將基因重組菌株CO和出發菌株PstDC3000進行發酵培養，對18 和28 ℃培養過程中菌株生物量(OD600)、發酵液pH以及發酵10 d后冠菌素產量進行檢測。由菌株的生長曲線(圖1)可以看出，在發酵培養1～2 d時，重組菌株CO的生長速度在28 ℃培養條件下明顯高于出發菌株，能較快達到穩定期，在18 ℃培養條件下與出發菌株相比沒有明顯差異，表明PoprL啟動子在28 ℃培養條件下有促進PstDC3000菌體生長的作用。

圖1 重組菌株CO和出發菌株DC3000的生長曲線Fig.1 Growth curve of recombination strain CO and original strain DC3000

從發酵液pH(圖2)來看，重組菌株CO與出發菌株相比，在18 ℃培養條件下差異明顯，出發菌株發酵液pH出現下降時間較早，而CO菌株發酵液pH下降緩慢且持續下降，在28 ℃培養條件下二者基本無差別。

圖2 重組菌株CO和出發菌株DC3000培養中pH變化情況Fig.2 Culture pH change of recombination strain CO and original strain DC3000

采用HPLC檢測發酵液中的冠菌素含量(圖3)，在18 ℃培養條件下，重組菌株CO冠菌素產量為15.21 mg·L-1，是出發菌株的1.8倍；在28 ℃培養條件下，重組菌株CO冠菌素產量為14.81 mg·L-1，是出發菌株冠菌素產量的4.1倍，由此可以看出，PoprL啟動子能夠促進丁香假單胞菌中冠菌素的生物合成表達。此外，在兩個不同培養溫度下，出發菌株冠菌素產量差異明顯，在18 ℃發酵條件下的冠菌素產量是28 ℃發酵條件下的2.4倍，表明出發菌株在高溫發酵條件下，冠菌素產量受到了明顯的抑制；而啟動子PoprL重組菌株CO在兩個溫度發酵培養條件下產量沒有明顯差異。從而表明啟動子PoprL能夠改善高溫對冠菌素產量的抑制作用。

圖3 重組菌株CO和出發菌株DC3000冠菌素產量Fig.3 Coronatine yield of recombination strain CO and original strain DC3000

2.3 基因重組菌株CO冠菌素合成調控相關基因qRT-PCR的檢測

將重組菌株和出發菌株在發酵培養基中進行培養，于接種24 h和48 h時取樣，采用qRT-PCR檢測了菌株冠菌素合成過程中連接酶基因cfl、冠菌酸合成酶基因cfa1、冠烷酸合成酶基因cmaA和調控相關基因編碼合成組氨酸激酶基因corS、RNA聚合酶σ54因子rpoN、RNA聚合酶σ因子hrpL的相對表達量，以出發菌株DC3000表達量為參照。從圖4中可以看到，冠菌素合成基因cfl和基因cfa1表達量在24 h變化較小，在培養48 h時出現了明顯的上調，并且cfl在28 ℃發酵條件下表達量上調程度高于18 ℃，而cmaA基因表達量在重組菌組CO中受到了抑制，在檢測樣品中表達量出現下調；冠菌素調控基因corS表達量在檢測樣品中都有上調現象，rpoN表達量在28 ℃時有明顯上調，hrpL表達量在28 ℃、48 h上調。這些結果表明啟動子PoprL對基因cfl和cfa1有明顯的增強表達作用，對冠菌素合成調控基因表達促進作用相對較小，在基因水平上驗證了啟動子PoprL對冠菌素生物合成的促進作用。

2.4 重組菌株COR致病性檢測

COR處理的葉片組織中觀察到的主要癥狀是強烈的廣泛性黃化，這種現象可以在多種植物上誘導產生[29]。為了鑒定啟動子重組菌株中COR生理活性，對菌株CO致病性進行檢測。將出發菌株和啟動子重組菌株CO分別注射接種擬南芥野生型Col-0，72 h后觀察兩株菌株的致病性，結果(圖5)表明，注射 MgCl2對照的葉片并沒有出現萎黃現象；在接種野生型PstDC3000的擬南芥葉片中出現了明顯的萎黃現象；接種啟動子重組菌株CO的葉片中也出現了明顯的萎黃現象。這些結果進一步表明，在出發菌株啟動子替換之后，PoprL啟動子能夠成功啟動冠菌素生物合成基因的表達。

圖4 重組菌株CO冠菌素合成調控相關基因qRT-PCR檢測Fig.4 qRT-PCR detection of coronatine synthesis and regulator genes in recombination strain CO

3 討論

目前，COR主要以微生物菌株發酵的方式獲得，在Pseudomonassyringaepv.glycinea4180發酵生產中，COR產量最佳溫度為18 ℃，而菌株培養最佳溫度為28 ℃;在低溫下進行菌株冠菌素生產，會導致其發酵周期較長，且消耗大量的能源，極大地加大了工業生產成本，因此溫度在一定程度上制約了COR發酵生產效率，從而限制了冠菌素的工業化生產及應用[30-31]。焦睿等[32]通過Tn5隨機誘變方法從874個突變株中篩選到2株28 ℃下產冠菌素菌株MFB132和MFB141，與出發菌株相比產量分別提高了19和21倍，但是插入位點和作用機制不明，推測其插入位點為溫度調控冠菌素生物合成的相關基因。Tn5隨機誘變由于插入位點不確定性，大大增加了菌株篩選工作量，且篩選效率相對較低。本研究通過定向的對啟動子基因進行重組改造，作用位點明確，所用方法便于篩選，并可以利用現有菌株資源構建高產菌株以及開展機制研究。此外,COR生物合成中冠狀連接酶基因cfl的轉錄受溫度影響，在18 ℃的轉錄活性高于28 ℃。分析cfl基因啟動子序列以及體外實驗驗證，發現COR合成前體CMA中cmaA基因和COR合成調控基因corS同樣受到溫度調控，且這些基因的啟動子中存在受溫度調節的轉錄激活因子corR蛋白結合位點[24]。這些結果說明，溫度對啟動子活性的調控作用影響了菌株中COR的生物合成表達，并且影響了COR最適產量溫度。因此，要想獲得高溫型產冠菌素菌株，應從COR生物合成中受溫度調控的基因和啟動子及其轉錄活性因子等方面開展工作。

A：Col-0注射MgCl2，CK；B：Col-0注射出發菌株DC3000；C：Col-0注射重組菌株COA: Col-0 injected with MgCl2, CK; B: Col-0 injected with DC3000; C: Col-0injected with CO圖5 出發菌株DC3000和基因重組菌株CO致病性檢測Fig.5 Symptom on Arabidopsis wild-type col-0 inoculated with DC3000 and CO

用PoprL啟動子來表達惡臭假單胞菌 YMB001中gfp基因，分別于16、20、24、28和37 ℃下培養，對GFP表達量進行檢測，發現溫度對PoprL啟動子活性基本沒有影響[27]。本研究表明,PoprL啟動子重組菌株在18和28 ℃發酵培養條件下都能提高冠菌素的產量，對冠菌素生物合成表達具有促進作用，并且啟動子重組菌株28 ℃發酵條件下COR產量與18 ℃產量接近，表明溫度對其影響較小，而且在重組菌株中COR合成基因cfl和cfa1表達量明顯上調。因此，可以推測PoprL啟動子中可能不存在受溫度調節轉錄活性因子蛋白結合位點，而可能存在其他一些能夠調控COR合成的蛋白結合位點，這些需要我們進一步進行研究驗證。

冠菌素是一種具有開發前景的新型植物調節劑，在常溫下利用丁香假單胞菌發酵生產冠菌素的報道很少。本研究通過啟動子同源重組替換，成功構建了啟動子重組菌株CO，在18 ℃發酵培養條件下，冠菌素產量是出發菌株1.8倍，達到了15.21 mg·L-1，在28 ℃培養條件下，冠菌素產量是出發菌株4.1倍，達到了14.81 mg·L-1，有效地改變了高溫下冠菌素產量低的現象。本研究工作不足之處在于重組菌株的產量還不足以用于規模化生產應用，還需進一步深化改造來提高冠菌素產量，因此, 本研究中得到的重組菌株可為進一步構建冠菌素高溫高產菌株提供理論基礎，為開展冠菌素生物合成調控機理研究，為設計更有效的COR生物合成工程菌株和發酵生產工藝開辟新的思路和可能性。