沒食子酸酶法聚合

丁若男，李楠楠，傅佳佳,2，蘇靜

(1.江南大學 江蘇省功能紡織品工程技術研究中心，江蘇 無錫 214122;2.江蘇陽光集團，江蘇 江陰 214426)

沒食子酸是一種天然多酚[1]，又稱作3,4,5-三羥基苯甲酸，因其抗氧化[2]、抗炎、抑制細胞活性[3]和抗癌活性[4]而被廣泛應用。漆酶作為一種多酚的氧化還原酶[5]，它可引發底物形成自由基，自由基之間聚合生成有色聚合物[6]。酶染作用條件溫和、環保，在生態染整方面具有一定的優勢，也為紡織品生物染色提供思路[7]。

本文選用沒食子酸單體作為漆酶作用的底物，催化合成低聚物或高分子化合物。基于漆酶催化酚類單體產生自由基進而聚合生成有色多聚物，并通過不同的測試方法，對聚合產物的結構和性能進行表征。因聚合產物顯示有色，后續可能會用于紡織品的染色和功能整理[8-9]。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

漆酶(Trameteshirsuta)，實驗室自制；沒食子酸(GA)、2，2-聯氮二(3-乙基苯并噻唑)二胺鹽(ABTS)、醋酸鈉、醋酸、2，5-二羥基苯甲酸、KBr粉末、二甲基亞砜(DMSO)均為分析純。

CP114電子天平；移液槍;Thermo Mixer微型反應器；Synergy H1酶標儀；SK2510 HP超聲水浴鍋;Q500熱重分析儀;Q200差示掃描量熱儀;美國Labconco FreeZone 2.5 L臺式凍干機；Microflex LT飛行時間質譜儀；Nicolet is10傅里葉變換紅外光譜儀；Bruker AduanceⅢ全數字化核磁共振波譜儀。

1.2 酶活測試

稱取ABTS固體(2.8 mg)溶解在去離子水(10 mL)中，通過檢測在420 nm處ABTS+自由基所變化的吸光度值來確定漆酶酶活。首先，選用0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液(pH=5.0)分別制得0.5 mmol/L的ABTS溶液和濃度適宜的待測酶溶液，然后從以上兩種配制好的溶液中分別取用100 μL充分混合，迅速用酶標儀讀取混合液吸光度值，其中參數設置：420 nm處每間隔1 min測試1次，總計10 min。1個漆酶活性單位(U)指的是：室溫條件下在1 min內氧化能夠得到1 μmol ABTS+自由基所需的酶的總量[10]。

1.3 聚合實驗

稱取(10 mg/mL)沒食子酸單體適量，將其溶解于10 mL醋酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L，pH=5)中，完全溶解后，加入漆酶(300 μL，100 U/mL)、羊毛織物(5 cm × 5 cm)，在40 ℃的微型反應器中以300 r/min振蕩，引發聚合反應。反應過程中確保反應液與空氣充分接觸。反應24 h后，取出織物，水洗后置于烘箱中40 ℃烘干。剩余反應溶液需離心、過濾，再將剩余液體經凍干機冷凍干燥處理，最后獲得聚合產物粉末，保存備用。

1.4 表征測試

1.4.1 紫外-可見分光光譜分析 利用酶標儀對聚合反應過程中不同反應時間的反應溶液進行紫外-可見吸收光譜掃描，繪制出不同時刻反應液在230～700 nm吸光度的變化曲線。

1.4.2 FTIR紅外-吸收光譜 稱取適量待測樣品與198 mg KBr粉末混合，研磨時間1～2 min，然后壓片。利用傅里葉變換紅外光譜儀對沒食子酸單體及其反應獲得的聚合產物分別進行測試。其中參數包括掃描范圍4 000～500 cm-1，分辨率4 cm-1，次數32次。

1.4.3 核磁共振氫譜分析 將沒食子酸單體及其聚合產物兩個測試樣品均以20 mg/mL的濃度溶解于DMSO溶劑并置于核磁管中標記，然后利用核磁共振波譜儀對每個樣品進行1H NMR測試，內標為四甲基硅烷(TMS)。

1.4.4 MALDI-TOF飛行時間質譜分析 將1 mg沒食子酸及其聚合反應產物分別溶解在0.2 mL TA30或者0.1%TFA中，取1 μL溶解后溶液與1 μL基質混合，取1 μL混合液點到樣品靶上，空氣中自然晾干，再利用飛行時間質譜儀(MALDI-TOF)在正離子反射模式下對樣品進行測試。

1.4.5 游離酚羥基含量測定 使用Folin-Ciocalteu[11]分光光度法測定聚合前后的游離OH基團總量。將溶解在DMSO(100 μL)中的單體和聚合產物溶液添加到Folin-Ciocalteu試劑(500 μL)和蒸餾水(6 mL)的混合物中，并將混合物振搖1 min。之后，將Na2CO3溶液(15%，2 mL)加入到混合溶液中搖動1 min。通過添加蒸餾水將溶液補足至10 mL。2 h 后，在750 nm(25 ℃)下測量吸光度。

1.4.6 熱重分析 稱量5 mg待測試樣品放入鋁制坩堝中，利用熱重分析儀，設置其升溫速度10 ℃/min，由25 ℃升至600 ℃，整個測試將置于流速為60 mL/min的N2環境中。

1.4.7 差示掃描測試分析 稱取5 mg的待測樣品，將其放入DSC固體坩堝中，利用差示掃描量熱儀將法蘭溫度降至-80 ℃，進行測試。設置其升溫速率為10 ℃/min，從40 ℃升溫至400 ℃，于流速為50 mL/min的N2氛圍中進行測試。

1.4.8 聚合產物粒徑測定 將聚合產物溶解于合適的介質中，在環境溫度下利用Zetasizer nano ZS分析儀對反應所得產物膠束的平均粒徑大小及多分散指數進行測試，并觀察粒徑的分布狀況。

2 結果與分析

2.1 紫外-吸收光譜

由圖1可知，沒食子酸單體溶解在醋酸鹽緩沖溶液中呈無色透明狀，在260 nm紫外區由于苯環振動存在π→π＊電子躍遷，可見光區沒有吸收峰。隨著時間的變化，反應24 h的反應液在380 nm左右出現了新的吸收峰，B帶紅移，但是漆酶的加入并沒有對反應液紫外區吸收光譜產生影響，這也說明沒食子酸單體間的聚合對苯環結構沒有影響[8]，但是反應過后產物的共軛體系變大，從而產生了有色聚合產物。

圖1 反應24 h后反應液的紫外吸收光譜Fig.1 UV absorption spectrum of the reaction solution after 24 h of reaction

2.2 紅外光譜分析

對沒食子酸單體和沒食子酸聚合物的FTIR分析結果見圖2。

圖2 沒食子酸單體及其聚合產物紅外吸收光譜圖Fig.2 Infrared absorption spectrum of gallic acid monomer and its polymerization products

由圖2可知，沒食子酸和沒食子酸聚合產物的紅外吸收光譜存在明顯差異。沒食子酸單體在3 498,3 287 cm-1存在明顯的羥基(—OH)伸縮振動吸收峰，但聚合產物中該波段的峰明顯減少，說明沒食子酸單體在漆酶催化作用下發生了氧化，部分酚羥基被氧化失去了氫原子。沒食子酸單體在1 607，1 539，1 428 cm-1處是苯環結構的伸縮振動吸收峰，同聚合產物對比可得，聚合產物在1 600～1 200 cm-1苯環的骨架振動吸收峰發生了明顯變化，由此也表明沒食子酸單體發生了氧化聚合反應。1 189，1 132 cm-1為C—C伸縮振動吸收峰，可推測聚合產物中各重復單元是以碳鏈的形式連接的。單體曲線中865，734 cm-1分別是苯環上的相鄰氫，從框選部分可以看到，聚合物圖譜中已經不存在，說明苯環上的部分氫參與了聚合反應。

2.3 核磁共振氫譜分析

核磁結果表明,與沒食子酸單體相比，聚合產物的羥基含量明顯降低，即沒食子酸在漆酶催化氧化作用過程中，酚羥基被氧化(見圖3)。化學位移δ10.5～13是—COOH的化學信號，在聚合過程中，由于空氣中含有氧氣，通過漆酶4個銅離子協同催化作用，與空氣中的氧氣接觸催化底物氧化和對氧氣的還原；δ8～9是苯環上氫鍵的信號，但是單體和聚合產物相比可以看出，聚合產物在δ8.85，δ9.28處的信號消失，說明苯環上部分氫被取代，顯示出較弱信號或無信號；δ6.5～8是苯環上酚羥基的氫的電化學信號，同上發生取代，為了進一步測定，通過Folin-Ciocalteau方法對聚合物中游離酚羥基的含量進行了檢測。結果見圖4，將沒食子酸底物的酚羥基含量作為標準，發現漆酶催化后所得聚合產物溶液中游離酚羥基含量顯著減少，從而進一步說明沒食子酸酶法聚合過程中酚羥基參與到氧化聚合反應，與核磁中酚羥基化學信號減弱結果相符合。

圖3 1H NMR圖譜沒食子酸(A)，聚沒食子酸(B)Fig.3 1H NMR spectrum gallic acid(A),polygallic acid(B)

圖4 游離羥基含量測定Fig.4 Determination of free phenolic hydroxyl groups

2.4 飛行時間質譜分析

通過MALDI-TOF 測試聚合物的分子量大小及其分布，不同聚合度聚合物分子量見表1。

表1 聚合產物MALDI-TOF測定相對分子量Table 1 Relative molecular weights of MALDI-TOF

沒食子酸酶法聚合所得產物的分子量大小主要分布于300～1 500 Da，這些是代表了不同聚合程度的沒食子酸的寡聚物(即從二聚體到八聚體)，主要峰的間距為182 Da，182表示失去兩個羥基并攜帶兩個Na+。412 Da是沒食子酸二聚體，其中兩個單體的對羥基、羧基上的氫均被Na+取代[12]；質荷比594，777，959，1 142，1 318，1 500附近的質譜峰分別對應的是沒食子酸的三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體和八聚體，呈現規律性變化，表明聚合反應形成低聚物的多樣性。推測在自由基聚合的整個過程中，沒食子酸分子間反應消耗了兩個酚羥基，且對位酚羥基和羧基均被取代，從而致使相鄰質譜峰間的質荷比差了182 Da，MALDI-TOF MS檢測為正離子反射模式，聚沒食子酸分子緩沖溶劑中鈉離子(Na+)加和，因此對應沒食子酸中的重復單元[C7H2O3]n2Na+。

2.5 熱性能分析

見圖5(A)，沒食子酸TG曲線顯示在0～224 ℃，沒食子酸質量基本保持恒定，當溫度升到256 ℃時質量損失率達到最高，約33.26%，結合DSC曲線在264 ℃出現明顯吸熱峰，可知，沒食子酸的分解溫度為264 ℃左右[13]，當溫度升至348 ℃時其損失率已經明顯超過50%，溫度升至600 ℃時質量損失率甚至達到73%；由圖5(B)可知，聚沒食子酸的DSC曲線顯示，在100 ℃之前可能是聚合產物中殘余試劑揮發導致失重，結合TG曲線可知，當溫度升至358 ℃時，聚沒食子酸失重速率明顯減緩，可能是聚合產物中低聚物先發生分解，隨著溫度的繼續升高，聚合度高的聚合物開始緩慢分解，最終溫度升至600 ℃時，質量損失率才達到56%，此外，聚沒食子酸的分解峰稍高于沒食子酸的分解峰，由此可以推出聚合產物具有較好的熱穩定性。

圖5 沒食子酸(A)和聚沒食子酸(B)的DSC和TG曲線Fig.5 DSC and TG curves of gallic acid(A) and polygallic acid(B)

2.6 粒徑大小分析

通過Zeta電位儀可對聚合物溶液中粒子的大小及分布情況進行了測試及分析。不同濃度的聚合產物粒徑測試結果分析如下：

漆酶催化所獲得的聚合產物以不同濃度溶解在水溶液中，粒徑均分布在200～300 nm范圍。低濃度聚合產物較高濃度聚合產物顯示出較小的粒徑，但分散均勻穩定性有一定程度下降。因此，可以看出，對于同種聚合產物以不同濃度存在時，濃度較大的分散體系就會表現出粒徑尺寸較大，相反濃度小的分散體系則呈現較小的粒徑尺寸，分散均勻性也有所變化[14]，后續會根據應用要求來選用合適溶解濃度。

表2 不同濃度聚合產物的粒徑分析Table 2 Particle size analysis of polymerproducts at different concentrations

3 結論

漆酶催化沒食子酸聚合，得到有色聚合產物，通過UV-Vis、紅外、核磁共振氫譜、飛行時間質譜對沒食子酸酶法聚合產物的結構進行測試、表征和分析，最終發現聚合產物其實是不同聚合程度的沒食子酸寡聚物(即從二聚體至八聚體)，從而推測出聚合產物可能的結構單元，但是具體的結構式需進一步研究說明。其熱性能表征結果可以看出聚沒食子酸具有較好的熱穩定性，因而可推測該聚合產物在酶染和功能改性中具有較好的應用前景。漆酶催化多酚類單體生成聚合物，這是一種比較新穎、先進的聚合物合成方法，但是由于漆酶存在重復利用率低、成本高等缺點，研究后續會考慮利用高能反應器來提高漆酶的利用率，以達到更好的應用效果，并且會對聚合物功能特性進行進一步研究，拓展其使用領域。