映山紅花瓣花色苷成分組成分析

賀葉風, 張春英, 劉群錄,*

(1.上海交通大學設計學院, 上海 200240; 2.上海植物園, 上海城市植物資源開發應用工程技術研究中心, 上海 200231)

映山紅(Rhododendronsimsii)是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(RhododendronL.)的常綠或半常綠灌木[1]，廣泛分布于我國長江以南地區及臺灣地區的丘陵或山地，花色鮮艷且開花繁茂，是很多杜鵑花品種的雜交親本[1]?；ㄉ侵参镒钪匾挠^賞指標，花瓣細胞中色素種類與含量是決定花朵最終呈色的一個重要因素[2]。目前關于杜鵑花科花色素的研究報道較少，涉及的物種也少[3]。Hang等[4]研究了來自越南和日本的映山紅(R.simsii)花瓣，檢測到了14種花色苷，但是只鑒定了其中2種花色苷，即矢車菊素 3-O-阿拉伯糖苷和矢車菊素 3-O-半乳糖苷；Liu等[5]研究了柳條杜鵑(R.virgatum)、猴斑杜鵑(R.faucium)、硬毛杜鵑(R.hirtipes)等10種杜鵑花屬植物花瓣的類黃酮，得到了5種花色苷和23種黃酮。近年來，杜鵑花花色苷研究報道有增加的趨勢，但仍有許多具有重要育種價值的杜鵑屬植物花色及花色素組成尚不清楚。本研究以中國原產映山紅的7個不同花色株系為材料，研究了其花色素組成以及與花色的關系，以期為杜鵑花花色改良提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自于大別山播種苗單株經擴繁形成的株系，代號分別為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5、Y6、Y7，種植于上海植物園苗圃。映山紅花瓣于2019年4—5月采集，于晴天上午9—11時，取花瓣，液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱凍存備用。

1.2 花色描述與測定

取盛花期的映山紅花瓣，利用第五版英國皇家園藝學會比色卡(Royal Horticultural Society color chart，RHSCC)對其花色進行描述。重復5次，取頻率出現最高的結果。目測和 RHSCC比色光源為非直射的日光光源(通常選擇北面射入的日光)。

花色測定按照張寶智等[6]方法，采用國際照明委員會(International Commission on Illumination, CIE)表色系統表征映山紅花瓣的花色。CIE表色系統的明度L*值、色相a*值、色相b*值在三維色度坐標系上，L*軸垂直于a*軸、b*軸組成的平面。L*值從0到100表示明度逐漸增加；紅綠屬性a*值由負值變化到正值，表示綠色減退、紅色增強；黃藍屬性b*值由小變大，表示藍色的減退、黃色的增強。

彩度C*和色相角h*分別根據以下公式計算。

h*=arctan(b*/a*)

式中，C*值表示到L*軸的垂直距離，距離越大，彩度越大。

1.3 花色苷總量的測定

花色苷總量(total anthocyanin，TA)測定采用pH示差法[7]?；ò暝谝旱醒心コ煞?，稱取0.5 g樣品，加入5 mL的0.1%鹽酸甲醇提取液，10 000 r·min-1離心10 min后，取上清液待測。分別取1 mL提取液用pH 1.0和4.5緩沖液稀釋定容至3 mL。達平衡80 min后，分別測定520 nm的吸光度。用700 nm的吸光度作為模糊度的校正，以蒸餾水做參比液，以矢車菊素3-O-葡萄糖苷作為花色苷標準品?；ㄉ湛偭坑靡韵鹿接嬎?。

TA(mg·g-1) =AB/eL×MW×D×V/G×1 000

AB= (A520-A700)pH1.0- (A520-A700)pH4.5

式中，TA表示花色苷總量；AB表示兩個pH下吸光度的差值；Mw表示花色苷分子量(以矢車菊3-O-葡萄糖苷計，449.2 g·mol-1)；D為稀釋倍數；e為摩爾消光系數(以矢車菊3-O-葡萄糖苷計，29 600 L·mol-1·cm-1)；L為光程(1 cm)；G為花瓣鮮重(g)。

1.4 花色苷組分的定性分析

采用Acquity I-class超高效液相色譜和VION離子淌度四極桿飛行時間質譜聯用儀(UPLC-Q-TOF-MS)對花瓣中花色苷進行定性分析。超高效液相色譜條件為：色譜柱為WATERS ACQUITY UPLC BEH C18反相硅膠柱 (2.1 mm ×100 mm，1.7 μm)。流動相：A為0.1%甲酸水；B為0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度為0 min，5% B；3 min，20% B；10 min，100% B；12 min，100% B；15 min，95% B；19 min，95% B。流速：0.4 mL·min-1；進樣量1 μL；柱溫45 ℃；檢測波長520 nm。

質譜條件：正離子掃描 (ESI+，質荷比50～1 000)，毛細管電壓2.0 kV；錐孔電壓 40 V；錐孔氣流量50 L·h-1；霧化氣流量900 L·h-1；離子源溫度115 ℃；霧化氣溫度450 ℃。利用Mass Lyn×v4.1軟件分析質譜結果。

1.5 花色苷組分的定量分析

分別以矢車菊素3-O-葡萄糖苷(cyanidin 3-O-glucoside)、飛燕草素3-O-葡萄糖苷(delphinidin 3-O-glucoside)、錦葵素3-O-葡萄糖苷(malvidin 3-O-glucoside)、芍藥花素3-O-葡萄糖苷(peonidin 3-O-glucoside)、牽?；ㄋ?-O-葡萄糖苷(petunidin 3-O-glucoside)為標準品，通過標準曲線進行定量分析[8]，表示為每克花瓣重量對應苷元的毫克數。校準曲線如下。

矢車菊素類糖苷響應值(mAU)= 38 562×[Cy(mg·mL-1)]+15 766，R2=0.996 7

飛燕草素類糖苷響應值(mAU)= 21 920×[Dp(mg·mL-1)]-1 090.9，R2= 0.999 3

錦葵素類糖苷響應值(mAU)=46 634×[Mv(mg·mL-1)]-10 094，R2= 0.999 6

芍藥花素類糖苷響應值(mAU)= 58 894×[Pe(mg·mL-1)]+8 123.1，R2= 0.997 9

牽牛花素類糖苷響應值(mAU)= 58 072×[Pt(mg·mL-1)]-4 332.3，R2= 0.999 7

1.6 統計分析

使用Microsoft Office Excel 2013進行數據整理、分析及作圖，利用SPSS statistics 24軟件進行方差及顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 花色描述與測定結果

表1顯示，根據RHSCC比色結果，Y1、Y3、Y4三個株系的花瓣顏色屬于紅色系(red group)，Y2、Y6、Y7三個株系屬于紫紅色系(red-purple group)，Y5屬于紫色系(purple group)。7個映山紅花色在CIE表色系統坐標系上分布廣泛，亮度L*值介于47.94～68.38之間，紅綠屬性a*值的范圍介于29.25～49.84之間，黃藍屬性b*值介于-14.44～29.44之間，彩度C*值的范圍為29.25～55.56之間，色相角h*值的范圍為-89.36°～88.62°之間。由紅綠屬性a*、黃藍屬性b*值可以得知，映山紅是一個包含紅色系、紫紅色系在內的，色度在紫色到紅色區間內變化的顏色群體。

表1 7個映山紅株系花色的描述與測定值Table 1 Description and determination of petal coloration of 7 lines R. simsii

2.2 花色苷總量的測定結果

采用pH示差法測定各株系花瓣的花色苷總量，結果見圖1。從圖1可知，紅色系的Y1、Y3、Y4的花色苷總量相對較高。其中，Y4花色苷總量最高，達到了207.1 mg·g-1FW，是Y5的10倍左右。紫紅色系的Y2花色苷總量最少，僅為23.2 mg·g-1FW，輔助色素可能參與了其花瓣的顯色[9]。

圖1 7個映山紅株系花瓣花色苷總量Fig.1 Total anthocyanins content in petals of 7 lines of R. simsii

2.3 花色苷組分的定性分析結果

表2顯示，利用Acquity I-class超高效液相色譜和VION離子淌度四極桿飛行時間質譜聯用儀在7個映山紅株系花瓣中共檢測出5種苷元，13種花色苷。通過對各個組分質譜分子離子和特征離子分析，結合標準樣品，測定出5種苷元，分別為：矢車菊素(cyanindin，簡稱Cy)、飛燕草素(delphindin，簡稱Dp)、錦葵素(malvidin，簡稱Mv)、芍藥花素(peonidin，簡稱Pe)、牽?；ㄋ?petunidin，簡稱Pt)。確定了其中11種花色苷分別為：矢車菊素3-O-葡萄糖苷、飛燕草素3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素3-O-半乳糖苷、錦葵素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-阿拉伯糖苷、芍藥花素3-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-阿拉伯糖苷、錦葵素3-O-阿拉伯糖苷、牽?；ㄋ?-O-葡萄糖苷、牽?；ㄋ?-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素3-O-葡萄糖苷[8,10-15]。其中第12、13兩種物質是未能直接確定的花色苷。其中12號物質的二級質譜碎片質荷比為303.049 4與Dp一致，質荷比為465.102 5的碎片離子為Dp加1個六碳糖而成，結合光譜數據推定其為飛燕草素六碳糖苷。第13號物質的二級質譜碎片質荷比為301.070 1與Pe一致，質荷比為463.123 7的碎片離子為Pe加1個六碳糖而成，結合光譜數據推定其為芍藥花素六碳糖苷。這兩種花色苷的具體結構仍需進一步鑒定[16]。

2.4 花色苷組分的定量分析結果

從表3可以看出，除了株系Y2外，其他各株系中都含有矢車菊素類糖苷。在紅色系的3個株系Y1、Y3、Y4中，以Cy糖苷和Pe類糖苷為主，Y1、Y4 Cy類糖苷比例分別占96%、97%；Y3 Cy類糖苷比例為44%，Pe類糖苷比例為30%。在紫紅色系的3個株系中，以Dp類糖苷和Mv類糖苷為主，Y2 Dp類糖苷為41%、Mv類糖苷55%；Y6、Y7 Cy類糖苷分別為25%、26%，Dp類糖苷分別為52%、64%；除此之外，Y6、Y7還含Pt類糖苷比例分別為23%、10%。紫色系的Y5除了含有Cy類糖苷(15%)與Pe類糖苷(4%)，還含有Dp類糖苷(40%)、Pt類糖苷(38%)、Mv類糖苷(3%)。根據表3中結果可知，紅色系株系主要以Cy類糖苷和Pe類糖苷為主，紫紅系株系以Cy類糖苷、Mv類糖苷、Dp類糖苷為主，而紫色系主要為Dp類糖苷、Pt類糖苷。此外，偏紫色系的株系比紅色系株系的花色苷種類更多。Mizuta等[17]在分析杜鵑花花色時也發現，紫色花瓣中的花色素苷組成(2～6種花色素)比紅色花瓣(2～4種花色素)更加多樣化。由于芍藥花素3-O-阿拉伯糖苷、牽牛花素3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素3-O-葡萄糖苷響應值太低，表3中不計入。

表2 映山紅花色苷結構的鑒定Table 2 Identification of anthocyanin structure of R. simsii

表3 映山紅花色苷組分的組成及定量分析Table 3 Composition and quantitative analysis of anthocyanin components of R.simsii

2.5 花色與花色苷的關系

表4結果顯示，映山紅花瓣亮度L*與花色苷量總量(TA)呈顯著負相關關系(P<0.05)。紅綠屬性a*與TA無顯著相關性關系(P>0.05)；而黃藍屬性b*值、C*和h*分別與TA呈極顯著正相關關系(P<0.01)。表明花色苷量總量越高，花瓣的亮度越低，彩度越高。表5中回歸分析結果也說明了這一點。在各個花色苷中，Cy類糖苷含量與L*呈顯著負相關關系(P<0.05)，與TA、a*、b*、C*、h*都呈極顯著正相關關系(P<0.01)。說明Cy含量越高，花瓣亮度越低；花瓣越紅，彩度越高。Mv類糖苷與Pt類糖苷含量與黃藍屬性b*值和h*值均呈極顯著負相關關系(P<0.01)。表明Mv、Pt含量越高，花瓣越偏藍。從表5 中方程也可以看出，映山紅花瓣的紅綠屬性a*、黃藍屬性b*與Cy、Pe呈正相關關系，與Dp、Pt、Mv呈負相關關系。表明Cy、Pe含量越高，花瓣越紅，彩度越高；Dp、Pt、Mv含量越高，花瓣越偏藍，彩度越低，這一點與Du等[8]的研究結論相似。

3 討論

本研究通過分析映山紅不同株系的花色苷組分發現，偏紫色系株系的花色苷組成比紅色系花瓣更具多樣性，并且紫色系個體的a*和b*值在CIEL*a*b*坐標中比在紅色系中的a*和b*值分布更廣泛。不同色系花瓣花色苷總含量差異很大，紅色系花色苷總含量的平均值為104.25 mg·g-1FW，遠遠高于紫紅色系(34.11 mg·g-1FW)和紫色系(22.2 mg·g-1FW)。說明紅色花瓣中花色苷含量高，可能是花瓣存在某些轉錄因子上調花色素生物合成途徑或關鍵基因[18]。

Asen等[10]在對杜鵑花色苷的研究中采用薄層色譜檢測到矢車菊素苷元、芍藥花素苷元、錦葵素苷元；Mizuta等[18]采用HPLC法檢測到飛燕草素苷元和矮牽?；ㄋ剀赵籐iu等[5]研究了10種來自西藏的杜鵑花瓣花色苷，檢測到了矢車菊素苷元及錦葵素苷元。在本研究中共檢測出了5種苷元，分別為矢車菊素苷元、飛燕草素苷元、錦葵素苷元、芍藥花素苷元、牽?；ㄋ剀赵?；發現了13種花色苷，鑒定出了11種。其中，矢車菊素3-O-阿拉伯糖苷、矢車菊素3-O-葡萄糖苷、矢車菊素3-O-半乳糖苷、飛燕草素3-O-阿拉伯糖苷、飛燕草素3-O-葡萄糖苷與前人對于杜鵑屬花瓣花色苷種類檢測結果一致[10,16]；錦葵素3-O-阿拉伯糖苷、錦葵素3-O-葡萄糖苷、牽牛花素3-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-葡萄糖苷、芍藥花素3-O-阿拉伯糖苷和牽?；ㄋ?-O-阿拉伯糖苷6種花色苷為首次在杜鵑屬植物花瓣中檢測到，但在杜鵑花科藍莓果實中曾有過報道[11,13-15]。

表4 映山紅花色與花色苷的相關性分析Table 4 Relative correlation analysis between flower colors and anthocyanins of R. simsii

表5 映山紅花色與花色苷的回歸分析Table 5 Regression analysis between flower colors and anthocyanins of R. simsii

本研究中線性回歸與相關性分析顯示，映山紅花瓣的亮度L*與紅綠屬性a*之間有極顯著相關性，這與Liu等[5]的研究結果一致。并且a*與Cy類糖苷、Pe類糖苷含量呈正相關關系，說明Cy類糖苷、Pe類糖苷含量越高，花瓣顏色越紅。此外，Dp類糖苷、Mv類糖苷和Dp素類糖苷含量與b*呈負相關關系，表明這3類糖苷含量越多，花瓣越呈現藍色。這與Liu等[5]的研究結果一致。

花瓣中花色苷的種類和含量受相關基因的控制[18]。因此，研究映山紅不同株系間花色苷生物合成途徑中的結構基因和(或)調節基因在表達水平上的差異，可以進一步從分子水平上闡明映山紅花瓣呈色機理，為相關的育種工作提供科學依據。