脫馴化時長對煙草幼苗抗旱性的影響

張璐翔, 陳思蒙, 鄭聰, 金伊楠, 韓藝, 許自成, 黃五星, 邵惠芳*

(1.河南農業大學煙草學院, 鄭州 450002; 2.福建省煙草公司南平市公司, 福建 南平 354300; 3.河南省靈寶市五畝鄉農業服務中心, 河南 靈寶 472500)

大量研究及氣象觀測發現，氣候變化使得干旱這一世界性難題愈發嚴重[1]。正如人體通過鍛煉來增強身體機能，為適應日益加劇的干旱環境，植物能夠在干旱馴化中逐步提高自身抵御干旱脅迫的能力。有研究表明，經歷馴化的植株抗逆性、成活率及多種脅迫相關的基因表達都會顯著升高[2-3]。此前已有大量關于干旱及復水相關的研究，但多集中在多次馴化及復水對植株抗逆性的影響方面。隨著氣候變化的加劇，溫度及降水隨季節變化的規律愈發模糊，生長在自然環境中的植物面臨干旱脅迫的情況愈發普遍，而通過適宜鍛煉提升植物抗逆性逐漸進入研究者的視線。

干旱后復水導致植物抗旱性逐漸降低的過程被稱為脫馴化。與馴化過程需要較長時間不同，脫馴化通常在較短時間內就會產生[4]。因此，即使短暫的脫馴化也會對馴化效果產生較大影響。植株在經歷適宜時長的干旱馴化后及時復水能夠恢復正常生長，而長時間的干旱將會對植株產生不可逆的負面影響[5]。在低溫馴化中也有類似的研究結果[6]。因此掌握適宜的馴化及脫馴化時長是保證馴化效果的關鍵。

干旱脅迫產生后恢復正常水分供給對作物提升水分利用率、光合效率、氣孔導度及作物產量品質等方面有顯著影響[7-9]，而關于恢復正常水分供給的時長對干旱馴化效果的影響卻鮮有報道。隨著氣象學的發展，對未來短時間內干旱狀況的預測愈發準確。為防止干旱對作物產生不利影響，在播種或移栽前對植物進行適當的干旱馴化是十分必要的，而如何保證或優化鍛煉效果，目前仍然不知。為探究脫馴化時長對植株抗逆性的影響，本研究以模式植物煙草為研究對象，以脫馴化時長為變量，將馴化、脫馴化和再馴化三者相結合。將經歷不同時長脫馴化的煙草幼苗移入干旱環境進行再馴化后，測定煙草幼苗光合色素含量、滲透調節物質含量、根系活力、抗氧化酶活性、丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量等指標來探究不同脫馴化時長對植株抗逆性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取廣泛種植的煙草品種‘K326’作為試驗材料，由河南農業大學煙草學院育種實驗室提供。

1.2 試驗設計

試驗采取水培法，馴化過程包括馴化—脫馴化—再馴化三個階段。設置0(CK)、24(D1)、48(D2)、72(D3)h 4個脫馴化時間處理，各處理的馴化和再馴化處理一致，以正常培養作為處理N，5個處理具體試驗設計見表1。

表1 試驗設計Table 1 Experiment designation

試驗于2018年5—9月在河南農業大學品質生態實驗室人工氣候室內進行。光照強度為400 μmol·m-2·s-1，晝/夜溫度28/18 ℃，晝/夜時長14/10 h，濕度70%±5%。試驗用種子以10%過氧化氫消毒10 min，超純水沖洗并浸種8 h，隨后于育苗海綿上發芽。試驗所用Hoagland營養液為實驗室自配[10]。待煙苗長至4片葉時，選取長勢一致的幼苗，移至裝有蛭石的1.5 L黑色塑料盆并用1/2 Hoagland營養液澆灌，每3 d換1次培養液。待長至4片真葉時移至盛有Hoagland營養液的5 L水培盒中，每3 d換一次營養液，在更換營養液后第2 d對盒中營養液通氧。預培養3 d，選取長勢一致的煙苗進行處理。

干旱處理時，使用質量體積比為10%的聚乙二醇(PEG-6000,天津市科密歐化學試劑有限公司)模擬干旱環境，培養液水勢約為-0.15 MPa，屬輕度干旱。除脫馴化時長外，其余條件均保持不變。為避免光照對試驗的影響，設置每日7:00—21:00為人工氣候室光照時間。

1.3 檢測指標及方法

同一處理不同植株為1個重復，每個處理設置3次重復。干旱處理72 h后自上而下取完全展開的第2、3片葉混合作為取樣樣品。取樣時迅速取下煙草葉片冷凍于液氮中，移入-80 ℃超低溫冰箱保存。參照李合生等[11]方法測定葉片葉綠素、類胡蘿卜素含量；采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11]測定植株根系活力；分別采用氮藍四唑光還原法[12]、愈創木酚法[13]測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及過氧化物酶(peroxidase，POD)活性；采用氮藍四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)染色法[14]、二氨基聯苯胺(3, 3-diaminobenzidine, DAB)染色法[15]定位葉片· O2-及H2O2；分別采用硫酸蒽酮比色法[11]、酸性茚三酮法[16]、考馬斯亮藍G-250法[11]測定可溶性糖含量、脯氨酸(proline, Pro)含量及可溶性蛋白含量；MDA含量測定參照陳建勛等[17]方法。

以上各指標均采用Spark多功能微孔板檢測儀(瑞士TECAN公司)，按照使用說明及試驗設定相應參數進行檢測。

1.4 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2013初步整理各項數據，并使用DPS 7.05通過最小差異顯著法(LSD)進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同脫馴化時長對煙草幼苗光合色素含量的影響

不同處理的光合色素含量結果(圖1)顯示，除空白對照(N)外，各脫馴化處理中D2處理的總葉綠素含量最高，類胡蘿卜素含量則在D1處理中達到峰值，含量稍低于處理N且差異不顯著。總體上，總葉綠素和類胡蘿卜素含量均隨脫馴化時間延長呈現先上升后下降的變化趨勢。經歷馴化處理的植株總葉綠素含量均顯著高于CK，D1、D2、D3分別較CK上升120.65%、158.15%和113.95%，但3個處理間差異不顯著。而類胡蘿卜素含量則在D1處理中最高，且隨脫馴化時間延長，類胡蘿卜素含量呈現出明顯的先上升后下降的變化趨勢。處理D1、D2、D3相較CK類胡蘿卜素含量分別上升71.16%、34.05%和25.56%。說明馴化后的脫馴化時間能夠影響煙草植株的光合色素含量。

注：不同小寫字母表示同一指標不同處理間差異在P<0.05水平具有顯著性。Note：Different small letters of the same index indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖1 不同處理的煙株幼苗光合色素含量Fig.1 Photosynthetic pigment contents of tobacco seedlings under different treatments

2.2 不同脫馴化時長對煙草幼苗根系活力的影響

干旱脅迫除導致葉片萎蔫外，還能提升植株根系活力以增強植株吸取土壤水分的能力。因此，根系活力的強弱是直觀反映植株抗旱性的重要指標之一[18]。根系活力測定結果(圖2)可見，根系活力隨脫馴化時間延長呈先升高后降低的趨勢，在脫馴化48 h處理(D2)中達到峰值后下降。經歷脫馴化的幼苗根系活力顯著高于CK，D1、D2、D3處理較CK的根系活力分別上升120.60%、132.90%和86.30%。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有顯著性。Note：Different small letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖2 不同處理的煙株幼苗根系活力Fig.2 Root activities of tobacco seedlings under different treatments

2.3 不同脫馴化時長對煙草幼苗滲透調節物質的影響

植株通過累積滲透調節物質來應對逆境脅迫。逆境脅迫條件下，可溶性糖在葉片中的積累大于莖和根[19]，因此葉片中可溶性糖含量可以用于表征植物對脅迫的響應。由表2可知，煙草葉片可溶性糖含量隨脫馴化時間延長而降低，D1、D2、D3處理的葉片可溶性糖含量分別較CK顯著下降44.94%、67.26%和81.53%。脯氨酸含量常與植物的逆境脅迫程度呈正相關[20-21]。CK處理相較N處理脯氨酸含量上升，表明干旱脅迫誘導煙葉中脯氨酸累積，24 h的脫馴化處理(D1)使得煙株脯氨酸含量顯著升高，但脫馴化時間延長處理(D2、D3)的脯氨酸含量顯著下降，平均降幅為59.34%。CK處理的可溶性蛋白含量較N處理顯著升高，其隨脫馴化時長有明顯的先降低再升高的趨勢，D2處理達到最小值，相較CK下降69.98%，與N處理差異不顯著，但D3處理的可溶性蛋白含量又升高，達到與CK類似水平。

表2 不同處理的煙株幼苗滲透調節物質含量Table 2 Osmoregulation substance contents of tobacco seedlings under different treatments

2.4 不同脫馴化時長對煙草幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD通過清除細胞內多余的超氧根陰離子(·O2-)，從而使得細胞免受逆境導致的氧化損傷。SOD催化產物H2O2等則主要通過POD清除[22]。SOD及POD活性測定結果見圖3，可見，SOD和POD活性均隨脫馴化時間增長，呈先上升后下降的趨勢。SOD和POD酶活性在D2處理中達到峰值，且與處理N無顯著差異，但相較CK分別顯著升高40.02%、85.74%。D1、D3處理酶活性與CK差異不顯著。NBT可以將細胞內的· O2-染成藍色，DAB則與葉片中的H2O2反應呈現紅褐色，以此直觀地顯示葉片活性氧含量并反映抗氧化酶活性。NBT染色結果(圖4)表明，各處理著色情況與酶活性檢測結果具有良好的反向一致性。

2.5 不同脫馴化時長對煙草幼苗MDA含量的影響

非生物脅迫會導致植株產生氧化應激反應從而導致葉片MDA含量升高。由圖5可知，煙草幼苗MDA含量隨脫馴化時長呈先降低后升高的變化趨勢。葉片MDA含量以D2處理最低，比處理CK和D1分別顯著下降79.91%和77.78%，與N處理的幼苗MDA含量無顯著差異。并且MDA含量與抗氧化酶活性有相反的變化趨勢。

注：不同小寫字母表示同一指標不同處理間差異在P<0.05水平具有顯著性。Note：Different small letters of the same index indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖3 不同處理煙株幼苗的SOD和POD活性Fig.3 SOD and POD activities of tobacco seedlings under different treatments

圖4 不同處理的NBT和DAB染色葉片Fig.4 Dyed leaves by NBT and DAB under different treatments

3 討論

若植物一直處于干旱環境中則發生持續的干旱脅迫，只有給予一定周期的正常生長環境后植物再次接觸逆境才能驗證馴化的效果。對日本白樺樹(Betulaplatyphyllavar.japonica)研究表明，脫馴化環境差異越大，時間越長，植物再次受到脅迫時的損傷程度越嚴重[23]。本研究將0～72 h的脫馴化分為4個時間點，發現D3處理與CK處理差異不顯著，D2處理再次經歷干旱時各生理指標能夠基本達到N處理水平，表明脫馴化對植株抗旱性有促進效果。

逆境脅迫程度的加深常伴隨植株葉綠素含量的降低[24-26]。類胡蘿卜素具有保護葉綠素免受非生物脅迫傷害的作用[27-28]。本研究結果顯示，脫馴化時長能夠影響植株的光合色素含量。48 h的脫馴化會使干旱脅迫下煙草葉片維持較高水平的葉綠素及類胡蘿卜素含量，使光合作用正常進行，避免過剩光能造成的損害[29]。

注：不同小寫字母表示不同處理間在P<0.05水平具有顯著性。Note：Different small letters indicate significant difference among treatments at P<0.05 level.圖5 不同處理的煙株幼苗MDA含量Fig.5 MDA content of tobacco seedlings under different treatments

根系吸收外界營養物質的能力由根系活力反映[30]，適度的干旱脅迫能夠刺激根系生長，從而提升植株根系活力[31]。經歷不同時長脫馴化的植株幼苗根系活力有先升后降的趨勢，48 h脫馴化使得根系活力有顯著的提升。證明適宜時長的脫馴化是確保馴化效果的關鍵。

可溶性糖是重要的滲透調節物質，并通過糖代謝作為各種生理生化反應的能量來源或前體物質[19]。脯氨酸含量通常報道與植物抗逆性之間存在相關性，但是相關關系尚不統一[32-33]。可溶性蛋白含量是衡量逆境脅迫中蛋白質受損程度的重要因素[34]。本研究發現，可溶性糖及脯氨酸含量隨脫馴化時間延長有下降的趨勢，表明植株滲透調節平衡未被破壞，但短時間內快速改變生長環境會引起植物生長代謝紊亂。可溶性蛋白含量隨脫馴化時長有明顯的先升高后降低再升高的趨勢，表明干旱會促使植物合成適應逆境的蛋白質，而長時間的脫馴化會造成馴化效果減弱，從而導致植株再次進入脅迫環境后可溶性蛋白含量上升[35]。

綜上所述，馴化可以類比為人體接種疫苗來獲得對某種疾病抵抗力的過程，將脫馴化比作為獲得性免疫免疫力上升的過程，將再馴化比作免疫作用下降需要補種疫苗的過程。眾所周知，人體具有免疫記憶能力[41]。已有研究表明，擬南芥關鍵酶基因P5CS1的轉錄表達在再次響應鹽脅迫時具有“記憶”功能[42]。因此推測，植物響應干旱脅迫也有類似機制，并能夠通過馴化—脫馴化相結合的方式鍛煉這種“記憶”能力，從而可以遵從“綠色農業”的理念，在自然狀態下提升植株抗逆性而不依靠人工施用外源添加劑。