枸杞枝葉中乳酸菌的分離及其在徒長枝青貯中的應用評價

陳開瓊, 楊其芳, 茍琪, 呂燕, 劉建利

(北方民族大學生物科學與工程學院， 寧夏特殊生境微生物資源開發(fā)與利用重點實驗室， 銀川 750021)

寧夏枸杞(LyciumbarbarumL.)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)的藥用植物，根、葉、果都是寶[1-2]。枸杞徒長枝(俗稱“油條”)是在枸杞生長過程中產(chǎn)生的，一般是在良好的水肥條件下，由根、枝干上不定芽萌發(fā)后長成的一種生長過旺、發(fā)育不充實的枝條。由于徒長枝生長與果實主干枝競爭養(yǎng)分，在枸杞種植過程中被人工修剪后直接扔掉，全國枸杞產(chǎn)區(qū)每年總計產(chǎn)生約22萬t枸杞徒長枝[3-5]。研究表明，枸杞徒長枝中與枸杞子類似的營養(yǎng)成分和藥用成分，可提高動物免疫力，將其開發(fā)為飼料可以變廢為寶[6-11]。

青貯飼料是利用乳酸菌在密閉缺氧的條件下發(fā)酵得到的一種粗飼料，盡可能地保留了底物中的營養(yǎng)物質(zhì)，降低了粗纖維含量，并且柔軟多汁、酸香醇厚、適口性好、采食率高，同時避免了飼草季節(jié)性過剩[12]。乳酸菌是青貯過程的關(guān)鍵微生物，多由青貯底物上直接分離而來[13-15]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，枸杞鮮嫩枝葉在不添加任何外源青貯菌劑情況下自然青貯，品質(zhì)也不亞于添加商品青貯菌劑青貯的實驗組，推測其上附著大量適合青貯的天然乳酸菌。因此，本研究擬從新鮮枸杞枝葉上分離篩選生長快、產(chǎn)酸能力強、青貯品質(zhì)好的乳酸菌，旨在為后續(xù)開發(fā)枸杞青貯專用菌劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1青貯材料 枸杞品種為“寧杞一號”，枝葉于2018年9月采自銀川市西夏區(qū)地礦局農(nóng)場枸杞種植地。

1.1.2試驗試劑 亞芯秸稈青貯劑(臺灣亞芯生物科技有限公司)，糖蜜(廣西博華食品有限公司)，細菌基因組DNA提取試劑盒(DP2002，北京百泰克生物技術(shù)公司)，2×TaqPlus MasterMix (Dye)(康為世紀生物科技有限公司)，蜜二糖、苦杏仁苷、纖維二糖、核糖、木糖和乳酸鋰(上海源葉生物科技有限公司)，對羥基聯(lián)苯(上海麥克林生化科技有限公司)，其他常規(guī)生化試劑購自天津市大茂化學試劑廠。

1.1.3主要儀器 UV-1000紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)、S1000快速梯度PCR儀(美國Bio-Rad公司)、CelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司) 、PHS-3C pH計(上海精密科學儀器有限公司)。

1.1.4培養(yǎng)基 MRS培養(yǎng)基(1 L)：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、檸檬酸二銨2 g、牛肉浸粉10 g、無水乙酸鈉5 g、葡萄糖20 g、吐溫-80 1 mL、硫酸鎂0.58 g、磷酸氫二鉀2.6 g、硫酸錳0.19 g，碳酸鈣10 g，瓊脂 20 g，調(diào)節(jié)pH 為6.2～6.4之間。滅菌后搖勻倒平板即為MRS固體培養(yǎng)基。

PY培養(yǎng)基(100 mL)：蛋白胨0.5 g、胰酶解酪朊(Trypticase)0.5 g、酵母提取物1.0 g、吐溫-80 0.02%、鹽溶液4 mL。再加1.0 g葡萄糖為PYG培養(yǎng)基。

鹽溶液(1 L)：無水CaCl20.2 g、MgSO4·7H2O 0.48 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g、NaHCO310.0 g、NaCl22.0 g。

BTB-MR試劑(500 mL)：溴百里酚藍(BTB)0.2 g、甲基紅(MR)0.1 g，95%乙醇300 mL，蒸餾水200 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1乳酸菌的分離純化 參考孫敏等[16]方法從新鮮枸杞徒長枝上擇取完整且無病蟲害癥狀的葉片10 g，加90 mL無菌水， 120 r·min-1振蕩2 h，將洗滌液以10倍稀釋形成5個梯度稀釋液，從中取100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基平板上，每個梯度稀釋液涂布3個平板，放入已被蠟燭耗盡O2的玻璃干燥器內(nèi)，37 ℃微厭氧培養(yǎng)24 h。MRS固體培養(yǎng)基中添加1% CaCO3，據(jù)菌落的大小、顏色、形狀、水解圈的有無等挑取菌落，在MRS平板上重復劃線3次，得純化的菌株，以1%的量接種于MRS液體培養(yǎng)基，連續(xù)傳代2次后，加入25%甘油中，凍存于-80 ℃冰箱中。

1.2.2優(yōu)良乳酸菌株篩選 將活化后的菌株以1% 的量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃、120 r·min-1下培養(yǎng)24 h，每隔4 h測600 nm波長的OD值，同時測pH，繪制生長曲線和產(chǎn)酸速率曲線，比較后篩選出生長最快、產(chǎn)酸能力較強的優(yōu)良乳酸菌。

1.2.3乳酸菌菌株生化鑒定 參考《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[17]測定菌懸液中乳酸菌的系列生化指標，包括H2O2酶的性質(zhì)、消耗葡萄糖、葡萄糖酸鈉是否可以產(chǎn)酸產(chǎn)氣、能否直接發(fā)酵不同碳水化合物、發(fā)酵后產(chǎn)物能否造成明膠的液化以及了解H2S氣體是否產(chǎn)生，通過乳酸菌的生化特征輔助鑒定乳酸菌的種類。

1.2.4青貯實驗 將青綠少刺的的枸杞徒長枝鍘成1～2 cm的小段，混勻后分為若干份，每份500 g，按5%加入糖蜜，以加入0.01 g亞芯秸稈青貯劑作為對照，使用血細胞計數(shù)板計算與對照菌劑用量中細胞總數(shù)相當試驗菌株的用量，噴灑混勻，真空封口，室溫放置發(fā)酵。每個處理3個重復，青貯45 d后取樣分析。

1.2.5青貯后枸杞徒長枝感官評價 青貯結(jié)束后，打開乙烯塑料袋盡快進行感官評價，避免飼料因長時間觸氧而褐變氧化。參照中國青貯飼料品質(zhì)評價及德國農(nóng)業(yè)協(xié)會(DLG)評分法[18-19]評價飼料的pH、水分、氣味、色澤和質(zhì)地的表現(xiàn)。

1.2.6枸杞徒長枝青貯飼料營養(yǎng)成分和活性成分含量分析 參考《青貯飼料質(zhì)量檢測實用手冊》[20]和郭旭生等[21]方法分析9個常規(guī)營養(yǎng)成分：粗灰分、粗蛋白、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維、乳酸、氨態(tài)氮、水溶性碳水化合物、pH、干物質(zhì)，參考牛艷[22]和閆秀梅等[23]方法測定3個藥用成分：枸杞多糖、甜菜堿、黃酮。

表1 枸杞徒長枝青貯飼料感官評價標準Table 1 Score standard of valuation of sensory quality of Goji epicormic silage

1.2.7優(yōu)良菌株分子測定 參考孫敏等[16]方法提取菌株GJ8的基因組DNA。選通用引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和R1492(TACC-TTGTTACGACTT)擴增16S rDNA。反應體系(50 μL)：2×TaqPlus MasterMix (Dye)10 μL、模板1 μL、引物各1 μL、ddH2O 37 μL。反應程序:94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s；56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。反應產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢驗合格后，擴增產(chǎn)物與引物樣品送到昆泰銳(武漢)生物技術(shù)有限責任公司測序。經(jīng)BLAST比對，ML法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010處理數(shù)據(jù)，SPSS 20.1統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，Origin 8.0繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離篩選

2.1.1枸杞徒長枝葉上分離的乳酸菌 據(jù)MRS固體培養(yǎng)基上菌落初步形態(tài)，挑取出乳白色圓餅狀、邊緣整齊、水解圈大而明顯的菌株，劃線純化后共獲得15株乳酸菌：GJ1、GJ2、GJ3、GJ4、GJ7、GJ8、GJ10、GJ14、GJ15、GJ18、GJ19、GJ21、GJ22、GJ25、GJ27。

2.1.2篩選枸杞徒長枝中的優(yōu)良乳酸菌 15株乳酸菌的生長曲線如圖1所示，部分菌株在4 h后就進入對數(shù)生長期，第8 h到達生長頂峰，隨后進入平臺期。第8 h的OD值以GJ18、GJ2、GJ83株菌的最大，分別為1.71、1.48、1.30，說明GJ2、GJ8、GJ183株菌的生長速率快；據(jù)產(chǎn)酸速率曲線如圖2，大部分菌株隨著生長不斷產(chǎn)酸，在第16 h的pH最低，大都在3.90～4.20之間，無明顯差異。因此，選擇生長快、產(chǎn)酸能力較強的GJ2、GJ8、GJ18菌株進入后續(xù)試驗。

圖1 乳酸菌的生長曲線Fig.1 Growth curve of lactic acid bacteria

圖2 乳酸菌的產(chǎn)酸速率曲線Fig.2 Acid-producing ability curve of lactic acid bacteria

2.2 乳酸菌的生理生化鑒定

15株乳酸菌在過氧化氫酶觸、從葡萄糖和葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣、明膠液化和H2S產(chǎn)生四個生化鑒定試驗結(jié)果如表2，各菌株H2O2接觸酶顯陰性，H2S氣體產(chǎn)生呈陽性；明膠液化中僅GJ19、GJ25菌株呈陽性；在葡萄糖和葡萄糖酸鹽產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗中，各菌株均產(chǎn)酸，但添加葡萄糖時并不產(chǎn)氣，添加葡萄糖酸鈉時GJ2、GJ18、GJ25乳酸菌產(chǎn)氣，初步鑒定GJ2、GJ18、GJ25屬異型乳酸發(fā)酵菌，菌株青貯發(fā)酵后將會產(chǎn)生CO2，底物轉(zhuǎn)化利用率較低；GJ1、GJ3、GJ4、GJ7、GJ8、GJ10、GJ14、GJ15、GJ19、GJ21、GJ22、GJ27屬同型乳酸發(fā)酵菌，青貯效果更好。

表2 乳酸菌的生理生化鑒定結(jié)果Table 2 Result of physiological and biochemical identification of lactic acid bacteria

15株乳酸菌在不同碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗的結(jié)果如表3，在PY培養(yǎng)基中添加不同碳源培養(yǎng)后，各菌株均可發(fā)酵產(chǎn)酸，但菌株的生長速率與產(chǎn)酸能力存在差異，在葡萄糖、果糖、核糖、木糖和鼠李糖(pH在5.6～6.0之間)中表現(xiàn)最好，在麥芽糖、蔗糖、半乳糖、苦杏仁苷(pH在6.0～6.3之間)中次之；在甘露醇、山梨醇和纖維二糖中最差(pH在6.3～7.2之間)，但菌株GJ2除外；說明各菌株的發(fā)酵產(chǎn)酸情況為：糖類物質(zhì)>某些苷類碳水化合物>醇類物質(zhì)。

表3 乳酸菌的碳水化合物發(fā)酵試驗結(jié)果Table 3 Results of carbohydrate fermentation experiment of lactic bacteria

2.3 青貯枸杞徒長枝的感官質(zhì)量評價

以3種生長快、產(chǎn)酸能力強的菌株和亞芯秸稈青貯菌劑作為添加劑，青貯枸杞徒長枝的感官評價結(jié)果如表4所示。4種青貯枸杞徒長枝感官評定等級均為良好，說明乳酸菌GJ2、GJ8、GJ18和亞芯秸稈青貯劑感官無顯著差異，各分項指標中除水分外，色澤、氣味、質(zhì)地、pH等指標也無顯著差異，水分指標中以GJ8菌株青貯最低。但4種菌劑青貯pH均偏高，故需優(yōu)化枸杞徒長枝青貯材料的預處理措施及其他工藝環(huán)節(jié)。

表4 添加不同菌劑青貯枸杞徒長枝的感官質(zhì)量評價結(jié)果Table 4 Evaluation of sensory quality of epicormic silage of Goji inoculated with different microbial inoculates

2.4 青貯枸杞徒長枝營養(yǎng)成分的含量分析

以3種生長快、產(chǎn)酸能力強的菌株和亞芯秸稈青貯劑作為添加劑，青貯枸杞徒長枝營養(yǎng)成分的含量分析,結(jié)果如表5所示，3種菌劑青貯中粗蛋白、酸性洗滌纖維和對照亞芯秸稈青貯菌劑無顯著差異，其余營養(yǎng)成分指標均有差異。粗蛋白含量在1.68%～1.86%之間，酸性洗滌纖維含量在75.31%～78.34%之間；GJ8和亞芯青貯的粗灰分含量最高，與GJ2和GJ18差異顯著；GJ8、GJ2與亞芯青貯的中性洗滌纖維和可溶性碳水化合物含量最高，三者之間無顯著差異，但GJ18顯著較低；GJ8青貯的氨態(tài)氮最高，顯著高于其余3種菌劑；在干物質(zhì)含量指標上，GJ8卻顯著低于其余3種菌劑；亞芯和GJ18青貯的pH顯著低于GJ2和GJ8青貯；綜合考慮9個營養(yǎng)指標，GJ8的青貯效果最優(yōu)。

表5 添加不同菌劑青貯枸杞徒長枝中營養(yǎng)成分的含量Table 5 Contents of nutrients in epicormic silage of Goji inoculated with different microbial inoculates

2.5 青貯枸杞徒長枝活性成分的含量分析

以3種生長快、產(chǎn)酸能力強的菌株和亞芯秸稈青貯菌劑作為添加劑,青貯枸杞徒長枝活性成分含量分析結(jié)果如圖3，亞芯、GJ8、GJ18青貯中枸杞多糖含量在26.54～27.72 mg·g-1間，無顯著差異，顯著高于GJ2(22.24 mg·g-1)青貯；亞芯青貯的總黃酮含量最高(1.09 mg·g-1)，GJ8青貯(0.923 mg·g-1)次之，二者均顯著高于GJ18(0.70 mg·g-1)、GJ2(0.76 mg·g-1)青貯；亞芯和GJ8青貯的甜菜堿含量在6.01～6.13 mg·g-1間，也顯著高于GJ18(4.49 mg·g-1)、GJ2(3.74 mg·g-1)青貯。從3個枸杞活性成分指標看，GJ8的青貯效果與亞芯相近，優(yōu)于GJ2和GJ18青貯，故菌株GJ8可選作后續(xù)開發(fā)枸杞飼料的專用菌劑。

2.6 菌株的分子鑒定

菌株GJ8的生長速率、產(chǎn)酸能力和青貯效果最好，可作為青貯枸杞徒長枝生產(chǎn)飼料的專用菌劑。GJ8菌株經(jīng)細菌16S rDNA序列分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，GJ8菌株和乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)聚在一起，且節(jié)點支持度只有44%。因此，16S rDNA顯示GJ8菌株為乳酸片球菌，顯微也顯示球狀細胞(圖5)。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Note: Different lowercase letters in the figure indicate significant difference (P<0.05).圖3 各菌劑青貯枸杞徒長枝中藥用活性成分含量Fig.3 Content of the active pharmaceutical ingredients in Goji silage

圖4 基于GJ8菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of stain GJ8

圖5 菌株GJ8的細胞顯微形態(tài)(10×40倍)Fig.5 Microscope type of GJ8 cells(10×40 times)

3 討論

決定青貯飼料品質(zhì)優(yōu)劣的關(guān)鍵取決于乳酸菌能否迅速生長并大量繁殖、能否快速產(chǎn)生大量有機酸使生長環(huán)境的pH迅速下降，從而保證營養(yǎng)物質(zhì)的損失率達到最小。人為添加乳酸菌進行青貯，可以改變青貯飼料內(nèi)的微生物體系，使乳酸菌成為主要功能菌，進而調(diào)控青貯發(fā)酵，以提高青貯飼料的品質(zhì)。與商品青貯菌劑相比，植物上附著的天然乳酸菌適應性強，更能高效利用植物營養(yǎng)進行發(fā)酵。因此，較多研究針對植物上附著的天然乳酸菌進行分離，其中部分菌株表現(xiàn)出較好的功能[24-27]。本研究從枸杞徒長枝葉中上篩選篩出3株生長快、產(chǎn)酸能力強的乳酸菌應用于青貯枸杞徒長枝時的效果好，較底物上附著的其他雜菌的適應性更好，其生長優(yōu)勢及產(chǎn)酸優(yōu)勢能最大程度抑制其他微生物，如霉菌、酵母菌等生長呼吸對底物的消耗，延長底物的保存時間。其中，GJ8菌株作為菌劑，青貯枸杞徒長枝中營養(yǎng)成分含量優(yōu)于商品菌劑，其感官評價和藥用成分含量與商品菌劑相近，因此，可以作為后續(xù)開發(fā)枸杞青貯專用菌劑候選菌株。

目前，已從玉米、苜蓿、甜高粱、黑麥草等常見青貯底物中分離獲得青貯過程中的優(yōu)勢菌，大多分布乳桿菌屬(Lactobacillus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、腸球菌屬(Enterococcus)、片球菌屬(Pediococcus)[13-15]。而本研究篩選獲得的最優(yōu)菌株GJ8菌株也屬于片球菌屬。

青貯枸杞徒長枝中含有普通牧草欠缺的藥用活性成分，比如枸杞多糖、甜菜堿、黃酮等物質(zhì)，枸杞多糖可有效降低血脂和血糖，抗腫瘤、保護肝臟，增強機體免疫；甜菜堿可為機體提供-CH3；黃酮能使機體促生大量新的肝細胞，增強心臟收縮、減少心臟搏動數(shù)及抗氧化。梁小軍等[6]研究表明，飼喂家禽或反芻動物可明顯提高畜產(chǎn)品的品質(zhì)，故以枸杞徒長枝生產(chǎn)青貯飼料不僅變廢為寶，也可開發(fā)為獨特的中藥飼料添加劑。若在完善預處理措施，如選取鮮嫩少刺的徒長枝、預先碾壓柔化、加強密封、添加纖維素酶或其他乳酸菌復合青貯等，生產(chǎn)枸杞徒長枝中藥飼料添加劑，其市場前景十分可觀。