三氧化二砷對體外人小腸癌HIC細胞增殖的作用和機制*

楊云洪， 尹朝暉， 張汝一， 顏登國， 徐偉， 趙洋， 李國勝

(貴州醫科大學附屬醫院 肛腸外科， 貴州 貴陽 550001)

腫瘤的發生與異常的細胞增殖、分化以及凋亡密切相關，而細胞周期阻滯是導致細胞增殖抑制的主要原因之一[1-2]，因此當前腫瘤研究的熱點主要與細胞周期阻滯相關周期蛋白的研究有關。三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)作為中藥砒霜的主要成分，在多種實體瘤的治療中得到應用，并取得了良好的效果[3-4]。ATO可以通過多種機制發揮抗腫瘤作用，有研究發現下調細胞周期相關蛋白的表達可以阻滯細胞周期，進而抑制腫瘤細胞的增殖，是ATO發揮抗腫瘤作用的重要機制之一[5-6]。小腸癌是一種少見的消化道惡性腫瘤，可供研究臨床資料較少，目前國內外未見與ATO抑制小腸癌細胞增殖及其機制的研究報道，因此本實驗將ATO與人小腸癌HIC細胞進行體外培養，觀察ATO對小腸癌細胞增殖和細胞周期相關蛋白的表達，研究ATO在體外的抗腫瘤作用及機制，現將結果匯報如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞株及主要試劑 0.25%胰蛋白酶、RPMI-1640培養基均購自美國HyClone公司，人小腸癌HIC細胞株由美國ATCC細胞庫提供；兔多克隆抗體糖原合成酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、細胞周期蛋白B1(cyclin B1)、細胞周期蛋白D1(cyclin D1)及骨髓細胞瘤病毒癌基因(cellular-myelocytomatosis viral oncogene，c-Myc)均購自美國Santa Cruz Biotechnology Inc公司，辣根過氧化物酶 (horseradish peroxidase，HRP) 標記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)購于康成生物技術公司，HRP標記的羊抗兔二抗單抗購自Santa Cruz Biotechnology Inc公司，顯影液、定影液購于美國柯達公司，聚乙烯二氟(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜、ECL-Plus 發光試劑及高效顯影膠片均購于美國Amersham 公司。

1.1.2主要儀器 倒置顯微鏡購于日本尼康公司，BIO-RAD Power-pac 3000電泳儀購于美國 BIO-RAD公司，xCELLigence RTCA DP實時無標記細胞分析儀和E-Plate 16檢測板均由杭州艾森生物有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 復蘇凍存的人小腸癌HIC細胞， RPMI-1640培養液(含10%胎牛血清、1%雙抗)，5%CO2、37 ℃恒溫培養。定期更換培養液，取對數期生長的細胞用于本研究。

1.2.2ATO對人小腸癌HIC細胞增殖情況 取生長狀態良好的處于對數期的人小腸癌HIC細胞，調整細胞懸液濃度為1×105/mL，50 μL培養基加入E-Plate 16檢測板,同時檢測其背景阻抗值；將調整好的100 μL細胞懸液(細胞量為5～10×103/孔)加入到E-Plate 16檢測板孔中，放置入RTCA儀，在37 ℃恒溫5%CO2的條件下培養孵育24 h后，將10、15、20、40及60 μmol/L ATO加入各孔處理后作為實驗組；同時加等量磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline, PBS) ，設置為空白對照組。將檢測板再次放置入RTCA儀，監控時長設定為120 h，時間間隔設定為30 min，監測記錄細胞指數(cell index，CI)值，通過繪制的RTCA 系統動力學變化反應曲線，觀察檢測板孔中人小腸癌HIC細胞的生長狀況。

1.2.3人小腸癌HIC細胞周期相關蛋白cyclin D1、GSK-3β、cyclin B1、c-Myc的表達 取處于對數期的人小腸癌HIC細胞，在5%CO2的37 ℃恒溫條件下培養人小腸癌HIC細胞株2 d后，將10、15、20及40 μmol/L ATO加入培養皿中處理作為實驗組，另設空白對照組加等量PBS，5%CO2的37 ℃恒溫繼續培養2 d，收集各組細胞。將各組細胞裂解后，按常規方法提取細胞蛋白，通過BCA法測定各組蛋白濃度。取上述各組蛋白50 μg，適量蛋白加樣緩沖液稀釋后，95 ℃加熱變性10 min。SDS-PAGE電泳分離蛋白，濃縮膠電壓80 V，分離膠電壓100 V；經半干式電轉儀(80 V穩壓、4 ℃及2 h)轉至PVDF膜上，置于含5%脫脂奶粉的Tris鹽酸吐溫緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)溶液，閉光室溫封閉2 h。TBST洗滌后，將膜置于一抗稀釋液(兔多克隆抗體GSK-3β、cyclin B1、cyclin D1及c-Myc按照1 ∶500稀釋)，4 ℃過夜孵育，置于二抗稀釋液(HRP標記的羊抗兔二抗按照1 ∶5 000稀釋)，室溫振搖孵育2 h，TBST洗滌3遍，以GAPDH作為內參蛋白，ECL發光液A液和B液等體積混合液處理后，置于暗盒中進行曝光、顯影和定影，各組的條帶灰度值通過數碼圖像分析系統進行掃描分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 ATO影響人小腸癌HIC細胞的增殖

通過RTCA系統連續監測，其結果顯示，實驗組經過10、15、20、40及60 μmol/L ATO處理后的人小腸癌HIC細胞CI值均較空白對照組明顯下降，其下降趨勢隨著ATO濃度的增加更明顯。見圖1。

圖1 連續監測不同濃度ATO對人小腸癌HIC細胞增殖的影響Fig.1 Real-time monitoring of cell proliferation of human small bowel cancer HIC by different ATO concentrations

2.2 人小腸癌HIC細胞周期相關蛋白cyclin D1、cyclin B1、GSK-3β及c-Myc的表達

Western blot檢測結果顯示，10、15、20及40 μmol/L ATO組人小腸癌HIC細胞GSK-3β、cyclin B1、cyclin D1及c-Myc等相關周期蛋白的表達水平均較空白對照組均下降(P<0.05)，且隨著ATO濃度的增高，周期相關蛋白的表達水平越低。見圖2。

注:A為蛋白電泳圖，B、C、D及E分別GSK-3β、cyclin B1、cyclin D1及c-Myc的定量表達；(1)與空白對照組比較，P<0.05。圖2 不同濃度ATO影響人小腸癌HIC細胞周期相關蛋白的表達Fig.2 Expression of HIC cell cycle-related proteins of colorectal cancer affected by different concentrations ATO

3 討論

ATO可以通過抑制腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞的凋亡、誘導腫瘤細胞的分化、抑制腫瘤新生血管的形成及下調端粒酶活性等多種途徑抑制腫瘤的生長[7-8]。有研究報道[9]，ATO可通過降低非小細胞肺癌A549細胞端粒酶的活性，誘導腫瘤細胞的凋亡，抑制腫瘤生長。Tan等[10]在大鼠肝細胞癌模型中發現，ATO可以明顯降低腫瘤組織中微血管密度，抑制新生腫瘤血管形成。在本研究中，通過RTCA系統監測經不同濃度的ATO處理后的人小腸癌HIC細胞增殖情況，結果顯示ATO可以明顯抑制人小腸癌HIC細胞的增殖，表明抑制腫瘤細胞的增殖是ATO抑制小腸癌細胞生長的重要途經。

細胞周期調節失控是腫瘤細胞異常增殖的主要原因，因此抑制腫瘤細胞增殖可以通過阻滯細胞周期實現[11]。細胞周期分為分裂期(M期)和分裂間期，分裂間期又分為DNA合成期(S期)、DNA合成前期(G1期)及DNA合成后期(G2期)[12-13]。Park等[14]研究發現，ATO可以阻滯腫瘤細胞由G1期向S期轉化，細胞周期停滯于G1期，S期細胞減少，G2/M期細胞增加，從而抑制腫瘤細胞的增殖。Shao等[15]研究同樣證實，ATO可以使MKN 45 細胞停滯于G2/M期，G2/M期細胞明顯增多，S期細胞減少。細胞周期的變化是一個復雜的過程，受細胞周期蛋白(cyclin )、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物(cyclin dependentki-naseinhibitor， CDKI)及細胞周期蛋白依賴性激酶CDK三類物質嚴格的調控[16-17]，G1/S、G2/M是該調控過程中主要的關鍵性限制點[18]。

cyclin D1是目前研究最深入的cyclinD亞型，是控制細胞由G1進入S期的關鍵蛋白，cyclin D1的持續高表達或異常表達，導致G1期縮短及細胞周期調控紊亂，使腫瘤細胞異常增殖[19-20]。曹琦等[21]證實，cyclin D1的作用是使Rb蛋白磷酸化，后者與轉錄因子E2F解離后，使細胞進入S期，而ATO可以下調cyclin D1的表達，使腫瘤細胞停滯于G1期，抑制腫瘤的生長。潘洪濤等[22]研究也發現，ATO可以通過下調cyclin D1，阻滯細胞周期，抑制人膽囊癌裸鼠移植瘤的生長。在本研究中，經不同濃度ATO處理后的人小腸癌HIC細胞，通過Western blot檢測cyclin D1的表達，結果顯示相對于空白對照組，ATO可以明顯下調人小腸癌HIC細胞cyclin D1的表達，從而抑制人小腸癌HIC細胞增殖。cyclin B1是調控G2/M期的重要蛋白，與CDK1結合后形成有絲分裂促進分子(mitosis promoting factor，MPF)，驅動細胞由G2期進入M期[23]。已有研究證實[24]，cyclin B1與腫瘤的發生密切相關，在許多腫瘤組織中異常高表達，如乳腺癌、胰腺癌及卵巢癌等。Park等[14]等報道，ATO可通過下調腫瘤組織cyclin B1的表達，使腫瘤細胞停滯在G2/M期，進而抑制腫瘤增殖。本實驗結果發現，經ATO處理后的人小腸癌HIC細胞cyclin B1表達明顯下降，表明ATO可以下調人小腸癌HIC細胞中cyclin D1的表達，進而抑制腫瘤增殖。GSK-3β是細胞內多種信號轉導通路中的重要成分，可通過結合降解β-catenin從而影響調節Wnt 信號通路[25-26]。有研究發現[27]，GSK-3β可以直接抑制β-catenin對cyclin D1的降解，促使腫瘤細胞由G1期進入S期，下調GSK-3β的表達可以抑制腫瘤的生長。本研究將ATO與人小腸癌HIC細胞培養后，檢測結果顯示GSK-3β表達明顯下降，表明ATO可以下調人小腸癌HIC細胞中GSK-3β的表達，進而抑制腫瘤增殖。c-Myc是一種核內磷酸化蛋白，在乳腺癌、結腸癌及宮頸癌等惡性腫瘤組織中高表達，c-Myc可以上調cyclin D和CDK的表達，加速腫瘤細胞的G1/S轉換[28-29]。Chen等[30]研究發現，在體外敲除腫瘤細胞中c-Myc基因，使細胞周期停滯，抑制腫瘤細胞的增殖。在本研究中，ATO處理人小腸癌HIC細胞后，發現人小腸癌HIC細胞C-myc均不表達，表明ATO可以通過下調c-Myc的表達，抑制人小腸癌HIC細胞增殖。

綜上所述，ATO可以在體外抑制人小腸癌HIC細胞的增殖，同時明顯下調細胞周期相關蛋白cyclin D1、cyclin B1、GSK-3β及c-Myc的表達，可能是ATO抑制人細胞增殖的重要機制之一。本研究在細胞及蛋白水平上初步探討了ATO對體外人小腸癌HIC細胞的作用及其可能的機制，但沒有進行動物體內實驗，因此下一步打算進行動物體內實驗，在基因水平上探究其機制及可能的信號通路。