卡介苗對支氣管哮喘大鼠氣道重塑及血清HIF-1α表達的影響

王 磊，沈懷云，陳 信，諸宏偉，徐家新，鄭迎娟，陳 云，宣愛麗，徐家麗

支氣管哮喘因嚴重影響病人的生活質量及遠期預后，已成為呼吸系統常見的慢性疾病之一[1]。尤其是兒童病人，因臨床表現及發作形式多樣化，且患兒就診時對于病史及癥狀描述不確切，更是增加了診斷的難度，導致診治不及時，隨著病程的遷延，患兒出現進行性加重的氣道狹窄和不可逆性的氣道重塑。因此，早期診斷和治療兒童支氣管哮喘的重要性不言而喻。促使哮喘向慢性疾病演變的重要因素在近年來的研究中被發現，主要是由于氣道炎癥及氣道重塑，它們在哮喘發展過程中起著重要的病理生理作用[2]。有研究[3]表明，卡介苗(bacillus calmette-guerin,BCG)通過免疫調節，發揮其減輕氣道上皮細胞損傷及間質轉化的作用，從而減輕哮喘性氣道炎癥和氣道阻塞，但目前國內外對BCG在改善氣道重塑的作用機制方面進行報道的相關文獻較少。本研究著重探討在BCG干預下，支氣管哮喘大鼠氣道重塑情況以及血清缺氧誘導因子-1α(hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α)的表達情況，旨在為臨床控制哮喘癥狀、改善哮喘病人預后提供實驗室依據，現作報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取清潔級健康雄性SD大鼠30只，10～12周齡，由維通利華廠家提供，在層流實驗室進行喂養，提供喂養所需的專用飼料及專用水。

1.2 實驗主要材料 BCG，購自成都生物制品研究所有限責任公司；卵白蛋白(OVA)，購自索萊寶公司；氫氧化鋁，購自天津化學試劑三廠；二甲苯、無水乙醇購自中國國藥；Citrate 檸檬酸鹽緩沖液(pH6.0)、PBS 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2～7.4)、蘇木素染液、中性樹膠，購自中杉金橋生物科技有限公司；大鼠HIF-1α檢測試劑盒，購自上海西唐生物科技有限公司。

1.3 實驗主要器材 全自動脫水機(ASP200S)、石蠟切片機(RM2235)、烤片臺(HI1220)、水浴缸(HI1220)、加熱石蠟包埋系統(G1150 H)，正置熒光顯微鏡(DM3000)，均產自德國萊卡(Leica)設備有限公司；酶標儀(Spectra Max M5)，產自Molecular Devices公司；空氣壓縮霧化器(PARIBOYNO56)，產自德國百瑞公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 將30只SD大鼠按照隨機數字表法分成對照組、哮喘組和BCG治療組，每組10只。飼養條件為室溫20 ℃左右、空氣濕度60%左右的清潔環境，在光照-黑暗各交替12 h條件下分籠飼養，獨自攝食和飲水，各組大鼠用藥前均測量體重，實驗過程中嚴格遵守無菌操作原則。

1.4.2 動物模型建立 哮喘組大鼠在第1天和第8天，腹部皮膚消毒，腹腔注射10% OVA+氫氧化鋁混合液(每毫升0.9%氯化鈉溶液含100 mg OVA和100 mg氫氧化鋁干粉)1 mL致敏。從第15天開始用1% OVA(每毫升0.9%氯化鈉溶液含10 mg OVA)進行霧化吸入，每天1次，每次20 min，共2周，使大鼠致敏；當大鼠出現口唇發紺、呼吸急促、肢體抽動、喘息、打噴嚏、煩躁不安等癥狀時，表明激發試驗成功。對照組大鼠制模方法同哮喘組，在相同的時間點進行腹腔注射和霧化吸入處理，但區別在于使用的是0.9%氯化鈉溶液來替代OVA和氫氧化鋁。BCG治療組大鼠制模方法同哮喘組，每天霧化前半小時使用BCG 0.025 mg[4]進行皮內注射。

1.4.3 標本制作 在末次激發后24 h，對3組大鼠進行標本收集。(1)血清標本：采用乙醚吸入的方法將大鼠進行吸入麻醉，當大鼠四肢松弛，刺激無疼痛反射后，取仰臥位固定在解剖板上，在劍突下呈V字形剪開皮膚，剪斷兩側胸廓暴露心臟，用枸櫞酸鈉抗凝管在心尖處使用真空采血針采取約5 mL新鮮血液，輕輕晃動試管，使血液與抗凝劑充分混勻，在20 ℃冰箱中放置30 min，4 000 r/min離心15 min。使用一次性清潔吸管從離心完成后的標本吸取上清液于容積2 mL的EP管中，放置在-80 ℃冰箱保存，備用，以進一步檢測HIF-1α。(2)肺組織標本：采血結束后快速進行氣管和肺組織分離，操作過程中需注意輕柔以避免肺組織損傷。首先用血管鉗在剪下右肺前夾閉右側主支氣管，用0.9%氯化鈉溶液沖洗剪下的右肺，然后將肺組織表面液體用無菌紗布吸干，在4%多聚甲醛中浸泡48 h固定標本，梯度乙醇脫水和二甲苯進行透明處理，石蠟包埋。組織切片宜選取右肺中葉，切片厚度為3 μm，烤片后備用。

1.4.4 HE染色 肺組織切片常規脫蠟至水，在配置好的Weigert鐵蘇木素中染色5～10 min；用酸性乙醇分化液分化，水洗；用Masson藍化液返藍，水洗1 min；蒸餾水洗1 min；麗春紅品紅染色液染色時間為5～10 min；在上述操作過程中將蒸餾水∶弱酸溶液按照2∶1的比例配置成弱酸工作液，用弱酸工作液洗1 min；磷鉬酸溶液洗1～2 min；用配置好的弱酸工作液洗1 min；直接入苯胺藍染色液中染色1～2 min；用配置好的弱酸工作液洗1 min；95%乙醇快速脫水；無水乙醇脫水3次，每次5～10 s；二甲苯透明3次，每次1～2 min；中性樹膠封固。

1.4.5 ELISA檢測 取大鼠血清，嚴格按照試劑盒說明，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定HIF-1α的血清含量,記錄數據。

1.5 觀察指標 運用圖像分析軟件測量支氣管內徑周長(Pi)、支氣管管壁面積(WAt)、支氣管平滑肌總面積(WAm)等指標，并將測量所得的WAt值和 WAm值用Pi進行標化，分別代表支氣管管壁厚度(WAt/Pi)，支氣管平滑肌厚度(WAm/Pi)。

1.6 統計學方法 采用方差分析和q檢驗、Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 3組大鼠肺組織病理形態學比較 通過光學顯微鏡進行觀察，對照組大鼠肺組織肺泡形態正常，排列均勻，肺泡壁未見明顯增厚，氣管及血管結構均正常；哮喘組大鼠肺組織肺泡壁有明顯增厚，視野可見大量炎性細胞浸潤，氣管腔內可見明顯黏液殘留，模型構建成功；BCG治療組大鼠肺組織整體結構趨于正常，表明BCG對大鼠哮喘有治療作用(見圖1)。

2.2 3組大鼠ELISA檢測結果 3組大鼠血清HIF-1α表達水平比較，哮喘組> BCG治療組>對照組，差異有統計學意義(P<0.01)(見表1)。

表1 3組大鼠血清HIF-1α表達水平比較

2.3 3組大鼠肺組織氣道形態學指標變化情況 與對照組比較，哮喘組和BCG治療組大鼠WAt/Pi均升高(P<0.01和P<0.05)，哮喘組大鼠WAm/Pi升高(P<0.01)；與哮喘組比較，BCG治療組大鼠WAt/Pi和WAm/Pi均降低(P<0.01和P<0.05)(見表2)。

表2 3組大鼠WAt/Pi和WAm/Pi的比較

2.4 3組大鼠HIF-1α的表達水平與氣管形態學變化指標的相關性分析 結果顯示，大鼠血清HIF-1α與支氣管壁厚度和支氣管平滑肌厚度之間呈正相關(r=0.618、0.503，P<0.01)。

3 討論

支氣管哮喘的發病率呈現逐年上升趨勢，其發病率升高的原因可能和感染、環境污染、全球氣候變化以及霧霾天氣影響等諸多因素具有一定的相關性[5]。而且由于本病易反復發作，病程遷延，嚴重影響病人的生活質量及遠期預后，已成為呼吸系統常見的慢性疾病之一。目前哮喘防治的重要參考指南主要依據全球哮喘防治創議(Global Initiative for Asthma,GINA)方案[1]，并處于不斷更新中，中華醫學會兒科學分會呼吸學組則制定了《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》[6]。控制哮喘發作藥物及緩解病情藥物是該指南中治療支氣管哮喘的主要藥物分類，這些藥物主要用于控制哮喘的氣道炎性反應以及氣道痙攣，在哮喘急性發作期控制臨床癥狀，在臨床緩解期則用于預防喘息的急性發作。但是隨著近年來研究的不斷深入發現，隨著病程的進展，哮喘的可逆性氣流受限是可以發展為不可逆轉的肺功能損害的。此類支氣管哮喘病人，通常存在病情嚴重、病程時間長、主動或被動吸煙、持續接觸過敏源和職業刺激物、持續的氣道內炎癥性反應等諸多因素中的一項或多項。并且近年來研究發現哮喘發病的各個環節中均伴有氣道重塑的參與，因此認識到氣道炎癥及氣道重塑在哮喘的病理生理發展過程中同時進行[7]，共同參與了哮喘的發病過程。

活的牛型結核桿菌在體外經230代減毒培養后制成的活BCG，在臨床上主要用于免疫接種，以預防人類結核病的發病。死BCG則由活BCG經高溫滅活而成，除了短時間內用于結核免疫外，目前多數用于呼吸道疾病的輔助治療，可用于治療支氣管哮喘等自身免疫性疾病[8]。

機體在缺氧狀態下產生的HIF-1α是一種氧依賴性轉錄激活因子，是缺氧條件下關鍵細胞存活蛋白，已被確定為介導細胞對缺氧反應的重要轉錄因子，廣泛參與機體的炎癥和免疫反應，在不同條件下促進細胞存活和凋亡。HIF-1α在嗜酸性粒細胞趨化性中的作用曾由LAURA等[9]在研究髓系細胞HIF-1α誘導和調節哮喘發病機制的作用中做過首次評估，嗜酸性粒細胞HIF-1α的缺失可降低其趨化性，證實了髓系細胞中的HIF-1α在哮喘發病機制中起著重要作用，特別是在氣道高反應的發展中起著重要作用。減輕過敏性氣道炎癥反應及新生血管形成[10-11]，可通過抑制HIF-1α的表達或其活性而實現。

本研究發現，在BCG的干預下，治療組大鼠肺組織整體結構趨于正常，相對于哮喘組大鼠肺組織肺泡壁明顯增厚、大量炎性細胞浸潤、氣管腔可見明顯黏液殘留等情況而言，BCG對大鼠哮喘有明確的治療作用。同時BCG干預組大鼠血清中HIF-1α的表達水平較哮喘組出現明顯降低，說明BCG能夠有效減輕過敏性氣道炎癥反應及新生血管形成，抑制氣道上皮間質轉化,減緩氣道重塑，是通過抑制哮喘大鼠血清中HIF-1α表達而發揮作用，證實了BCG治療支氣管哮喘的臨床可行性。

本研究項目的意義在于為BCG在臨床上治療支氣管哮喘提供理論依據，減輕患兒家庭的經濟負擔，減少醫療資源浪費，對提高患兒的生活質量及遠期預后，有著重要而深遠的意義。