土壤有機碳組分化學測定方法及碳指數研究進展

張方方，岳善超*，李世清*

（1.西北農林科技大學資源環境學院，陜西 楊凌712100；2.西北農林科技大學黃土高原土壤侵蝕與旱地農業國家重點實驗室，陜西 楊凌712100）

土壤是陸地生態系統中最大的碳庫，碳儲量約2 500 Pg，約是大氣碳庫（760 Pg）的3.3倍，約是陸地生物量的4.5倍[1]，因此，探索土壤碳庫功能并采取合理的管理措施，對于調控全球碳匯具有重要意義[2]。對于農業生態系統而言，土壤碳庫容量決定著農田土壤質量和農業可持續發展程度[3]，而農業管理措施是影響農田土壤有機碳（Soil organic carbon，SOC）含量的重要因素。SOC對土壤的物理、化學和生物特性都有影響[4?6]，是土壤肥力的關鍵屬性，常被認為是評價土壤質量的重要指標，但總有機碳（Total organic carbon，TOC）并不是土壤質量變化的敏感指標[7]。活性有機碳（Labile organic carbon，LOC）由土壤中含碳的化學和生物組分共同組成，在TOC中比例較小，但它可以在短時間內降解，且直接作為微生物活動的能量來源，并參與土壤生物化學轉化和土壤養分循環，對碳輸入和農業管理措施具有高度響應，因此，被認為是SOC變化的初始和敏感指標[8?10]。

土壤有機質的礦化過程主要是非生物機制氧化或代謝過程的生物催化，因此，最初用于分析土壤有機質的方法是基于氧化途徑的，如Walkley?Black標準氧化法[11]。由于氧化過程引發了碳從有機形態到無機形態（CO2）的變化，因此土壤有機質穩定性研究變得至關重要，出現了利用氧化性梯度遞減的方法，如KMnO4氧化法[12]和改進的Walkley?Black氧化法[13]；由于微生物受含碳底物的生化特征影響，而且許多指標（如C/N）被提出都是基于這一觀點，因此酸水解方法應運而生[14]。這些測定方法可以將土壤有機碳庫分為不同的組分，它們不僅可以在不同程度上反映SOC的有效性，也可以通過相關碳指數來系統監測土壤質量的動態變化[15?16]。碳庫管理指數（Carbon management index，CMI）被認為是定量評價土壤質量指數的最有效工具[15，17]。固碳指數（Recalcitrant index，RI）可以有效評估農業管理措施對土壤惰性有機碳（Recalcitrant organic carbon，ROC）的影響[18]。CMI可以作為農業管理措施引起土壤質量變化的早期指標，用于評估和改進現有農業管理措施，也有助于增加土壤有機碳庫和改善土壤質量[17]。ROC是土壤有機碳庫的穩定組分，可以在土壤中長期停留，而且將碳固定在土壤中也是一種既能提高糧食產量又能改善土壤質量的雙贏策略[19]。

SOC組分的測定包括不同的實驗方法和限制因素，深入了解各測定方法分類SOC組分的特點是正確解釋實驗結果的關鍵。當前針對土壤有機碳庫分類的研究已有很多[20?23]，但大多未能清楚闡釋各測定方法分類SOC組分的優缺點、適用范圍及其與碳指數之間的關系。本文旨在在前人研究的基礎上，比較不同測定方法分類SOC組分的異同點，梳理SOC組分與碳指數之間的關系，并在此基礎上明確了需進一步研究的重點問題，為揭示土壤碳循環機理、監測土壤質量動態變化和提高土壤固碳潛力提供參考。

1 SOC及其組分化學測定方法

1.1 Walkley?Black標準氧化法

1.1.1 原理

Walkley和Black[11]在1934年最先利用K2Cr2O7?H2SO4溶液測定SOC。該方法原理是在濃硫酸稀釋放熱條件下，用過量的K2Cr2O7?H2SO4溶液氧化SOC，剩余的重鉻酸鉀用標準硫酸亞鐵滴定，由所消耗標準硫酸亞鐵的量計算出TOC。

1.1.2 特點和適用范圍

Walkley?Black氧化法廣泛適用于土壤、植物、巖石等固體樣品的SOC含量測定。與干燒法相比，干燒法工序繁瑣而且需要特殊的設備，而該方法操作簡便、快速，有足夠的準確度，適用于大批量樣品的分析，但該方法只能氧化77%的SOC，且無法細分SOC組分。

1.2 KMnO4氧化法

1.2.1 原理

Logninow等[12]最早于1987年提出利用不同濃度（33～333 mmol·L?1）KMnO4對SOC的氧化敏感性不同的原理來分選SOC組分。經過多年研究，33 mmol·L?1和333 mmol·L?1的KMnO4最終被作為一種溫和的氧化劑來模擬土壤有機質的酶分解[15，24]，并將TOC劃分為極易氧化有機碳（Very easily oxidizable carbon，VEO）、易氧化有機碳（Easily oxidizable carbon，EO）、可氧化有機碳（Oxidizable carbon，O）3個組分。組分1（CVEO）：被33 mmol·L?1KMnO4氧化的SOC。組分2（CEO）：被333 mmol·L?1KMnO4和33 mmol·L?1KMnO4氧化的SOC的差值。

組分3（CO）：TOC和333 mmol·L?1KMnO4條件下被氧化的SOC的差值。

Lefroy等[24]研究發現，在耕作土壤中被不同濃度KMnO4氧化的SOC是一種更敏感的指標，其中能被333 mmol·L?1KMnO4氧化的碳占比最大，間接表明這部分碳可能是活性組分。Blair等[15]在1995年修正了利用單一濃度KMnO4（333 mmol·L?1）氧化SOC的過程，并將SOC劃分為活性碳庫（Labile carbon pool，LCP）和惰性碳庫（Recalcitrant carbon pool，RCP），其中，在1 h內能被333 mmol·L?1KMnO4氧化的SOC被稱作活性有機碳（Labile organic carbon，LOC），而不能被氧化的部分被稱作惰性有機碳（Recalcitrant organic carbon，ROC），并由此提出了碳庫指數（Carbon pool index，CPI）和CMI的計算方法。LOC的快速測定，使得CMI被提出和易被計算。CMI可以實現對土壤碳庫的動態監測，不僅可以反映土壤碳庫對管理措施的敏感響應，也可以深入分析氣候變化、土壤利用方式等因素對CMI的影響，提高了對土壤質量的監控和管理水平[15，21]。

1.2.2 特點和適用范圍

KMnO4氧化法具有許多優點：KMnO4的深紫色能夠作為自己的指示劑；比微生物量碳（Microbial biomass carbon，MBC）測定方法操作簡單、快捷，無需預培養，受環境影響小，適用于大批樣品的分析；與TOC相比，333 mmol·L?1KMnO4確定的LOC與土壤氮、磷等養分和土壤理化性質相關性更高。但該方法也有要求實驗器皿潔凈度高和注意避光的缺點，而且，333 mmol·L?1KMnO4溶液也被認為濃度過于強烈，對于檢測某些土壤碳的活性變化不夠敏感。對此，有研究者提出降低濃度的解決辦法[25?26]。Weil等[26]使用了不同濃度（20～333 mmol·L?1）的KMnO4來測定LOC，結果顯示，稀釋濃度越低（20～33 mmol·L?1），對不同管理措施的敏感性越高，其中，20 mmol·L?1KMnO4在實驗室和野外利用手持色度計均產生一致的結果。這種在2 min內被20 mmol·L?1KMnO4氧化的SOC組分被稱為高錳酸鉀極易氧化碳（Permanganate oxidizable carbon，POX?C），POX?C與土壤微生物活性的大多數指標以及顆粒有機碳（Particulate organic carbon，POC）和SOC均顯著相關[27]。除濃度外，KMnO4氧化法也存在如受反應時間和土壤樣品水分含量影響[25?26]以及KMnO4在光照下分解或與MnO2反應等諸多問題[15]。

KMnO4與土壤中不同有機化合物的反應性，可以反映KMnO4氧化法的適用范圍。Blair等[15]的研究表明，13%～28%的SOC可被333 mmol·L?1KMnO4氧化。Tirol?Padre等[28]的研究顯示，333 mmol·L?1KMnO4不能氧化纖維素，但能夠氧化部分木質素；而33 mmol·L?1KMnO4與糖、氨基酸等有機酸反應緩慢，但對含有乙二醇官能團的化合物氧化速度較快。

雖然有研究顯示LOC與MBC和POC相關性較好[29]，但Tirol?Padre等[28]報道了LOC與MBC或水溶性碳（Water solution organic carbon，WSOC）之間僅存在弱相關性，認為該方法不是測定LOC的可靠方法。此外，芳香族結構和腐殖質與KMnO4發生反應的事實[28，30?31]，也使Tirol?Padre和Ladha對該方法分離SOC活性組分和穩定組分的有效性產生了懷疑。他們認為，由于缺少LOC與MBC和WSOC相關的證據，僅與總碳顯著相關，333 mmol·L?1KMnO4不能有效度量LOC，但能夠代表總碳中的穩定組分。

1.3 改進的Walkley?Black氧化法

1.3.1 原理

Walkley[13]最早于1947年提出通過梯度增加濃硫酸濃度來比較在增加氧化條件下提取的不同的可氧化SOC，該方法利用了不同濃度濃硫酸產生的反應熱不同，導致SOC的氧化程度不同的原理。Chan等[7]在2001年研究不同牧場可氧化有機碳組分與土壤質量的關系時，分別用酸?水溶液比為0.5∶1、1∶1和2∶1（對應硫酸濃度為6、9、12 mol·L?1）的濃硫酸測定可氧化碳的量，將TOC分為4個氧化性降低的部分，并定義為：極高活性有機碳（Very labile carbon，VL）、活性有機碳（Labile carbon，L）、低活性有機碳（Less labile carbon，LL）和非活性有機碳（Non?labile carbon，NL）。

第1部分（CVL）：被6 mol·L?1H2SO4氧化的SOC。

第2部分（CL）：9 mol·L?1H2SO4和6 mol·L?1H2SO4條件下被氧化的SOC的差值。

第3部分（CLL）：12 mol·L?1H2SO4和9 mol·L?1H2SO4條件下被氧化的SOC的差值。

第4部分（CNL）：TOC與12 mol·L?1H2SO4氧化的SOC的差值。

前兩部分共同構成LCP，后兩部分構成RCP[32]。

1.3.2 特點和適用范圍

改進的Walkley?Black氧化法相較于Walkley?Black標準氧化法只需使用一半的硫酸，同時可以將SOC細分為4個組分。與KMnO4氧化法相比，測定的SOC組分是研究土壤質量參數變化更敏感的指標[7]，有研究表明[33]，這兩種方法測得的SOC活性組分均是以新鮮植物殘渣轉變的穩定有機物且周轉時間小于10 a為特征的有機物。

一般情況下，LCP比RCP的損失要嚴重得多，這是因為LOC參與碳循環并釋放營養物質，而且土壤物理因素對活性組分的影響也極為重要[34]。隨著農田管理方式的改變，LCP變化相對較快，改進的Walkley?Black氧化法是研究土壤團聚體碳庫及在特定管理實踐下測定LCP和計算RI的有效工具。然而，土壤有機質是一種異構的復雜實體，由多種具有不同功能和生物利用度的化合物組成[35]，化學氧化測定過程破壞了SOC組分的生化穩定性。

1.4 酸水解法

1.4.1 原理

酸水解法可以有效研究土壤有機質的生化抗降解性。Berendse等[36]在1985年提出土壤中未分解植物殘體可以分為3個基本庫：不被木質素掩蔽的游離碳水化合物，被木質素掩蔽的碳水化合物（主要是纖維素），木質素本身。未分解的植物殘體中的木質素通常被量化為克拉森木質素，即濃硫酸水解后的殘渣；而大多數穩定有機聚合物（木栓脂、樹脂、蠟等）也具有耐酸水解的特性。因此，強酸的侵蝕可以作為分離SOC活性組分和穩定組分的標準[14]。Rovira等[14]于2002年利用酸水解法將土壤有機碳庫分為兩個活性程度不同的組分（不穩定組分1 Labile carbon pool 1，LCP1；不穩定組分2 Labile carbon pool 2，LCP2）和一個穩定組分（Recalcitrant carbon pool，RCP）。

LCP1：由2.5 mol·L?1H2SO4在105℃水解30 min得到。

LCP2：由13 mol·L?1H2SO4在室溫下水解12 h，然后在105℃下用1 mol·L?1H2SO4水解3 h得到。

RCP：未水解的殘渣。

不穩定組分1和不穩定組分2共同構成LCP，穩定組分構成RCP。

1.4.2 特點和適用范圍

酸水解法可以將土壤有機碳庫分為3個組分，但操作較為繁瑣。Rovira等[14]的研究表明，根據酸水解技術，有機質的顯著下降只發生在易分解的植物材料上，因此可以有效評價植物殘基的分解程度。

LCP1主要由來自于植物細胞或微生物細胞的非纖維素多糖組成，LCP2的主要成分是植物源纖維素，這些化合物具有較高的生物利用度，對環境變化具有敏感性[37?38]。因此，SOC活性組分通常被認為是土地管理措施變化前后有機碳動態變化的早期指標[39?40]。由于RCP的主要化合物是木質素、脂肪、蠟、樹脂、亞磷脂和腐殖質等高度耐生物降解的化合物[37?38]，SOC的化學組成和分子結構的抗逆性對SOC固定時間起關鍵作用，因此，SOC中RCP所占比例越高，其生物化學抗性越強[41?42]。通過改變土壤LCP和RCP的大小，可以改變SOC的生化抗性程度，進而影響SOC的固碳時長[43]。因此，可以利用該方法評估土壤活性碳組分和惰性碳組分對農業管理措施的響應，也可以通過計算RI更好地了解農業管理措施在區域和全球碳固定中所起的作用。

2 SOC組分與碳指數

2.1 SOC活性組分與碳庫管理指數（CMI）

碳庫管理指數是由碳庫指數（Carbon pool index，CPI）和碳庫活度指數（Lability index，LI）經過一系列計算得出的，計算公式如下[15]：

其中，CPI=樣品總碳含量/參照點土壤總碳含量；LI=樣品土壤碳庫活度/參照點土壤碳庫活度；碳庫活度=土壤活性有機碳含量/土壤惰性有機碳含量。

一般來說，活性有機碳是指能被333 mmol·L?1KMnO4氧化的有機碳，但改進的Walkley?Black氧化法對于可氧化碳更為細致的劃分，使得LI能夠被更加科學地計算。Majumder等[44]以改進的Walkley?Black氧化法的3個碳組分（CVL、CL和CLL）為基礎，根據其氧化難易程度配以各自權重3、2、1后相加，得到新的LI計算公式：

顯然，這也使得CMI的計算更加準確。由于化學氧化可能會氧化一些被礦物吸附的有機物，而這些物質被認為是不能用于生物活動的，而且化學氧化是一種表面氧化，大塊顆粒物內的一些不穩定化合物可能不會被氧化。對于化學氧化法的這些限制，Vieira等[45]提出利用密度分離法和粒徑分離法兩種物理分離法測定LOC含量，即輕組有機碳（Light fraction or-ganic carbon，LFOC）和POC。雖然化學分類法和物理分類法的原理完全不同，而且這兩種方法測定的LOC含量也不完全吻合，但其相同之處在于兩種方法都提供了一個評價LOC的相對指標，可以對管理措施進行比較評估，進一步完善了CMI評價體系[45]。

2.2 SOC惰性組分與固碳指數（RI）

RI是土壤惰性碳庫（惰性碳庫指不能被333 mmol·L?1KMnO4氧化的有機碳）和總有機碳庫的比值，該指數可以有效評估不同管理措施對土壤碳穩定性的影響[46]。但根據改進的Walkley?Black氧化法所分類的SOC活性組分和惰性組分，可以推導出兩種SOC固碳指數RI1和RI2[46]：

Jat等[47]研究表明，RI1在表層土壤中的值低于深層土壤，而RI2則相反；RI1在不同處理之間和不同深度間均呈現顯著差異，而RI2沒有任何顯著差異。這表明，RI1比RI2敏感。RI也與土壤中粉黏粒含量相關，粉黏粒會將SOC化合物吸附在團聚體表面，形成穩定SOC[48]；低土壤肥力和去除作物殘茬導致微生物降解有效性降低，也是提高RI的可能原因[49]；在較低層的穩定碳庫中，較高穩定碳含量可能是由于SOC通過土壤剖面向下移動時插入黏土晶格層所致[50]。

相對于改進的Walkley?Black氧化法，酸水解法不僅可以用于計算固碳指數（RIC），也可以用于計算固氮指數（RIN）[14]。

式中：CRCP為未水解的碳，CTOC為土壤總有機碳，CRNP為未水解的氮，CTN為土壤總氮。

3 基于文獻計量學的對比分析

為有效分析以上3種SOC組分測定方法的引用情況，本研究從Web of Science文獻數據庫檢索這3種測定方法報道文獻（KMnO4氧化法[15]、改進的Walkley?Black氧化法[7]和酸水解法[14]）在近19年（2001—2019）的年被引頻次（圖1）。由圖1可知，近19年來3種測定方法引用量均成上升趨勢，引用量順序為KMnO4氧化法＞改進的Walkley?Black氧化法≈酸水解法；近3年來的引用趨勢與整體趨勢不同，其引用量順序為KMnO4氧化法＞改進的Walkley?Black氧化法＞酸水解法。該結果大致可以表明，KMnO4氧化法占絕對優勢，而另外兩種方法在近幾年也被越來越多的研究者認可。

為比較近年來利用3種SOC組分測定方法計算CMI和RI的引用趨勢，利用Web of Science數據庫對引用3種SOC組分測定方法施引文獻結果進行檢索，設定檢索時間“2010—2019”，分別選擇“carbon management index”和“carbon sequestration”為關鍵詞進行檢索，并對檢索結果進行甄別，分別記錄3種方法在2010—2019年用于CMI計算和固碳研究的文獻數量（圖2）。由圖2a可知，對于CMI的計算，KMnO4氧化法的引用量遠高于其他兩種方法，但從2017年起利用改進的Walkley?Black氧化法計算CMI的研究開始逐漸增多。由圖2b可知，對于土壤固碳研究，3種方法使用量均在逐漸上升，其中，改進的Walkley?Black氧化法的增長速度最快，引用量已超過KMnO4氧化法。酸水解法在CMI計算和土壤固碳研究中的引用量均低于KMnO4氧化法和改進的Walkley?Black氧化法。這表明，KMnO4氧化法在計算CMI或評價LOC的研究中認可度較高，改進的Walkley?Black氧化法在碳固定研究中的認可度較高，而酸水解法在評價LOC和碳固定研究中引用量均相對較少。

4 結論與展望

4.1 結論

SOC活性組分被認為在許多與土壤生產力和環境恢復有關的土壤功能中起主要作用，可以作為反映土壤質量的綜合指標?，F有SOC組分化學測定方法有效區分了SOC的活性組分和惰性組分。綜合以上研究結果可知：KMnO4氧化法適用于LOC的測定和CMI的計算，且測定POX?C時能夠有效規避該方法的多數缺點；改進的Walkley?Black氧化法適用于土壤固碳研究和CMI的加權計算；酸水解法適用于以探究SOC生化穩定性為目標的SOC活性組分和穩定組分測定。

4.2 展望

根據現有研究結果及進展，圍繞SOC活性組分動態變化對農業管理措施的響應特點、提高農業管理措施對土壤ROC的固定能力以及如何建立更科學的碳指數或模型等重點問題，未來應該在以下幾個方面深入研究：

（1）實現測定方法的標準化，依據農業管理措施合理整合使用不同方法。雖然SOC組分的測定方法較多，但部分方法沒有統一的標準，如KMnO4氧化法在20～333 mmol·L?1的不同濃度下均可行，而且，反應時間、土壤含水量、光照強度等均會對測定結果產生影響。農業管理措施也會影響SOC組分的含量，如施用有機肥會增加SOC，而耕作則會減少SOC，而且物理、化學和生物分類方法均有自身的優點和缺點，在分析研究條件和研究目標后，從中選擇不同的方法可以實現優勢互補，也為研究土壤碳循環提供了一個新思路。

（2）完善SOC組分測定方法，定量比較區分不同SOC組分。當前，SOC組分的測定方法較多，表面上看各方法的機理和目標均不同，但實際所測得的各有機組分存在著諸多交叉和重疊，如以氧化效率區分的SOC組分與以化學組成區分的SOC組分在量上的關系仍不清楚，因此，定量區分各有機組分是解決LOC轉化研究問題的關鍵。除了量化比較各有機組分外，既可以利用同位素示蹤技術追蹤碳元素在土壤碳庫中的遷移轉化，也可以選擇如磷脂脂肪酸等具有特異性和穩定性的標記物來區分SOC來源，并不斷探索新的測定方法和技術。

（3）開展表層土壤固碳潛力研究，加強深層土壤固碳機理研究，結合“3S”技術評估區域土壤固碳潛力。農田土壤固碳潛力高，因為在大多數耕地中已觀察到表層SOC儲量明顯枯竭，但由于固碳潛力受到土壤環境和區域環境差異影響，因此難以合理量化估測。應當在土壤碳飽和假說基礎上建立土壤固碳潛力評估體系，系統比較各種農業管理措施下的固碳潛力，并選取合適的農業措施，以提高表層土壤碳儲量。雖然超過50%的碳位于30 cm以上的表層土壤中，但深層土壤碳的平均存在時間更長。但在有利于微生物活動的環境變化下（如溫度升高或LOC輸入），深層土壤碳和在表層一樣容易分解，因此，深入研究深層土壤固碳機理和影響因素有助于避免深層土壤碳的釋放。定量評估可能影響固碳潛力的主要環境參數，在此基礎上利用“3S”技術編制區域碳飽和虧缺表，即建立一個全面的區域土壤信息系統，該系統可以支持對SOC儲量的量化、監測和報告，從而強化對區域土壤質量的管理。

（4）定量分析LOC含量對異養微生物的限制，探索從微觀尺度建立土壤碳儲量變化新模型。微生物在土壤碳氮動態變化中處于核心地位，微生物碳源的限制反饋了植物對土壤養分的需求，從而解釋整個生態系統對非穩態條件的反應。LOC作為一種初級元素能量源，對異養微生物的生長最具限制作用。在沒有其他元素限制生長的前提下，可以利用閾值元素比率（Threshold element ratio，TER，指微生物本身的碳氮比與微生物對底物的氮、碳元素利用效率比值的乘積）來評估微生物所受到碳和氮的共同限制。

然而，固有的模型和指數不能有效反映微生物對SOC轉化效率的影響，也難以反映LOC變化的內在機理過程及其對環境的響應。因此，必須脫離以植物為中心的生態系統思維，利用新的分子技術測定和量化受碳限制的微生物如何驅動有機質的轉化。新模型需要集成土壤微生物群落資源可用性及生態系統養分循環和碳儲量變化多種因素，同時，充分研究養分比率、氣候和生態系統儲存和釋放CO2能力之間的反饋和交互影響，并將氮循環和磷循環引入到新模型中，以期為預測生態系統碳平衡提供一個強有力的工具。