模擬大氣鎘沉降量對空心菜種子發芽的影響

杜錦夢，易秀，崔鍵，王巍，常雅軍，劉曉靜，姚東瑞

（1.長安大學水利與環境學院，西安710054；2.江蘇省中國科學院植物研究所（南京中山植物園），南京210014；3.江蘇省水生植物資源與水環境修復工程研究中心，南京210014；4.長安大學旱區水文與生態效應教育部重點實驗室，西安710054）

我國是農業大國，農田是我國最重要的資源，近年來農田重金屬污染及相關食品安全問題受到廣泛關注[1?3]。據報道，我國農田土壤重金屬污染每年造成的損失達200多億元[4]，部分區域稻米和蔬菜鎘嚴重超標[5?8]，這與我國土壤鎘點位超標率居土壤無機污染之首有關。農田鎘污染的來源很多，越來越多的研究發現，大氣鎘沉降已成為農田鎘累積的重要來源[9?10]。據統計，每年我國鎘沉降輸入0.24～19.5 mg·m?2，占農田鎘輸入的34%～90%[11?16]。此外，鎘具有強毒性和高遷移性，對人體的危害較大[5，9，17?18]。因此，探索大氣鎘沉降及其農田生態環境效應、食品安全風險和相關機理，對大氣與土壤環境交叉學科的理解和農田鎘污染防控都具有重要意義。

種子的芽對外界環境的變化極其敏感，其發芽情況會直接影響植物后期的生長狀況[19]。種子發芽的源動力來自其吸脹作用，在水分進入種子內部的同時，鎘也會隨之進入，參與其生理代謝過程[20?21]。研究發現，高濃度鎘會降低生菜、桑樹、小麥種子的發芽率、發芽指數和活力指數[19，22?23]，而低濃度鎘則作用相反[19，24]。即使相同鎘濃度，不同的蔬菜品種甚至同一蔬菜的不同基因型對鎘的累積或響應也不盡相同[6?7，25?27]。這為鎘污染土壤的低鎘蔬菜品種篩選或超富集植物的發展提供一個新途徑。因此，開展大氣鎘沉降對種子發芽的相關研究，有利于進一步認識大氣鎘沉降的生態效應，同時，為大氣鎘沉降找到一種植物預警方式。

空心菜（Ipomoea aquatica Forsk.），學名蕹菜，是一年生的旋花科植物，可水陸兩生，因其營養豐富、適應性強、采收期長、口感好而備受人們的喜愛，而該蔬菜對重金屬具有較高的累積能力[28?30]，其食用的安全性一直備受關注[21，31?33]。此外，空心菜的品種眾多，不同品種對鎘的響應是不同的[23?24，34]。然而有關大氣鎘沉降對不同品種空心菜尤其是對種子發芽影響的認識仍存在一定的局限性。因此，本研究根據近年來大氣鎘沉降量范圍，設置低、中、高3個鎘沉降量梯度，選擇不同空心菜品種進行種子發芽實驗，根據種子的發芽勢、發芽率、發芽指數及活力指數篩選出對鎘耐受性最強和最弱的品種，并根據7 d的發芽情況進行發芽動力學分析[35?36]，以期為空心菜的安全生產及后期實驗提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試劑CdCl2·2.5H2O，用于配制模擬大氣鎘沉降通量溶液，來自源葉生物有限公司。

空心菜種子購自南京市金盛達種子有限公司，共6個品種，分別為白骨大葉、白骨柳葉、柳葉、雙機竹葉、特選泰國和正宗三叉。各品種的特性見表1。

表1 不同品種空心菜的特點Table 1 Characteristics of different varieties of water spinach

1.2 實驗設計

根據前期的研究結果，每年我國大氣鎘沉降的通量為0.24～19.5 mg·m?2[14，37]。在此基礎上，設置本研究模擬大氣鎘沉降通量為0、3.0、9.0、18.0 mg·m?2的4份種子發芽的培養液，標記為D0、D3、D9、D18，每個處理3次重復。在超凈工作臺，將處理后的種子，每30粒放入一個鋪有兩層脫脂棉且滅菌后的培養皿（直徑9 cm）中，再加入以上4份鎘培養液，移至已滅菌后的光照培養箱中恒溫（25±1℃）培養。此后，每隔24 h在超凈工作臺以去離子水補給培養皿中溶液蒸發和種子發芽所需水分，并記錄發芽種子（胚根超過種子自身長度的一半）的個數、根長和形態，處理霉爛種子（95%酒精消毒后放回原處繼續觀察，將嚴重霉爛的種子挑出，以避免感染其他種子，并將其統計為未發芽種子）。

1.3 試驗方法

1.3.1 種子預處理

從每個品種空心菜中，選擇顆粒飽滿、大小一致種子，用密封袋分裝好。試驗開始前，用0.2%CuSO4溶液分別在小燒杯中消毒15 min，為防交叉感染，每個品種在對應的小燒杯中單獨消毒。然后，將其在超凈工作臺上用無菌水反復沖洗數次，再用吸水紙將水吸干，放到密封袋中，待用。

1.3.2 大氣鎘沉降量配制

由于大氣鎘沉降量比較小，為保證稱量的準確性，故將本實驗模擬大氣鎘沉降量所用的鎘試劑一次稱量后，溶于水溶液進行配制。以D3為例配制培養液：沉降通量為D3的共有18個培養皿，以18個培養皿的面積計算出18個培養皿需要的CdCl2·2.5H2O的質量，加入36 mL去離子水，混勻后，每個培養皿加2 mL培養液。

1.3.3 測定指標及方法

（1）發芽勢是評判測試種子的發芽速度和整齊度的重要指標，是在種子發芽過程中，日發芽種子數達到最高峰時發芽的種子數占供試種子數的百分率，其計算公式為：

發芽勢=日發芽數峰值時發芽種子粒數/供試種子粒數×100%

（2）發芽率是評判種子質量好壞的重要指標，它是指發芽實驗結束時測試種子的發芽數占測試種子總數的百分比，能近似地反映出苗率。空心菜種子發芽時間一般為7 d[29，38?39]，故發芽率的計算公式為：

發芽率=試驗完成時（7 d）全部發芽種子粒數/供試種子粒數×100%

（3）根由種子的胚根發育而來，根長和鮮質量可以反映種子對外界環境的響應能力。其測定方法為：種子置床后第9 d，用直尺測定每株幼苗根的平均長度（mm）；用電子天平（精度0.001 g）測定幼苗的鮮質量，每個處理隨機選取10株幼苗測定，以其總質量除以種子數，得到每個處理的平均鮮質量。

（4）發芽指數和活力指數是體現種子對環境抗逆能力差異的重要指標，前者是發芽率指標的細化和深化，后者是種子發芽速率和生長量的綜合反映，二者放大了種子活力的特征，使好壞種子的差異加大。本文使用根長和鮮質量兩個指標進行活力指數的計算，分別記為根長活力指數和鮮質量活力指數。具體計算公式為：

發芽指數（GI）=∑（Gt/Dt）（Gt為t時間內的發芽數，Dt為相應的發芽天數）

活力指數=種苗生長量（平均根長或平均鮮質量）×發芽指數

（5）發芽動力學曲線，可以直觀地表現出種子發芽過程中發芽速度的快慢和發芽時間，以及大氣鎘沉降量對其發芽速度的影響。通過發芽時長與對應日發芽數量繪制而出的變化曲線。

（6）相關性分析，可以衡量兩個變量因素的相關密切程度。本文中用于衡量各個發芽指標與大氣鎘沉降量之間的相關性。

1.4 數據處理

采用SPSS 26.0軟件對數據進行單因素方差分析、LSD多重比較和相關性統計分析，Origin 2018軟件對數據進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 模擬大氣鎘沉降量對空心菜種子發芽勢及發芽率的影響

圖1為模擬大氣鎘沉降量處理下6個品種空心菜種子的日發芽數。由圖可知，無鎘沉降處理下，供試空心菜種子的日發芽數峰值出現在第2～4 d，其中品種柳葉的最早，為第2 d；白骨大葉和雙機竹葉的最遲，為第4 d。大氣鎘沉降處理下，供試空心菜種子的日發芽峰值類似，僅白骨大葉和雙機竹葉兩個品種在D3和D18處理的日發芽峰值提早1 d。可見，柳葉空心菜種子具有發芽快速的優勢，而白骨大葉和雙機竹葉空心菜種子的發芽峰值受大氣鎘沉降量的影響較大。

基于空心菜種子7 d的發芽情況，分別估算了不同大氣鎘沉降量下6個品種的發芽勢和發芽率（圖2A、圖2B）。從圖2A可見，白骨柳葉品種的發芽勢為78.89%～84.44%，顯著高于其他品種（P＜0.05），且隨大氣鎘沉降量的增加，其發芽勢雖有波動，但差異不顯著（P＞0.05），說明白骨柳葉種子的發芽速度較快，整齊度較高。特選泰國品種的發芽勢次之，且受鎘沉降量的影響較小。柳葉和正宗三叉的發芽勢相當，但受大氣鎘沉降量升高的影響，柳葉的發芽勢遞增，且D9和D18處理的發芽勢顯著高于D0處理；正宗三叉的發芽勢隨大氣鎘沉降量升高而波動，D3處理顯著高于D9處理。雙機竹葉和白骨大葉的發芽勢受大氣鎘沉降量的影響相似，都隨鎘沉降量增加而波動下降，D3和D18處理的發芽勢顯著低于D0處理。可見，大氣鎘沉降量對空心菜種子發芽勢的影響與種子本身特性關系較大。

從圖2B可見，品種柳葉、特選泰國和白骨柳葉的種子發芽率最高（87.78%～95.56%），且三者無明顯差異（P＞0.05），而白骨大葉的最低，僅為48.89%，顯著低于其他5個處理，說明前者種子質量較好，后者則較差。隨著大氣鎘沉降量的增加，白骨柳葉和雙機竹葉的種子發芽率呈先增后降的趨勢，且D3處理的發芽率顯著高于D18處理的；而其他4種的發芽率雖有波動，但無明顯差異。可見，白骨柳葉和雙機竹葉的種子發芽率對大氣鎘沉降量相對敏感。

2.2 模擬大氣鎘沉降量對空心菜種子根長和鮮質量的影響

第9 d，大氣鎘沉降量模擬下6個品種空心菜種子的平均根長如圖2C所示。D0處理下，白骨柳葉和特選泰國的根長最長，分別為17.93 cm和17.01 cm，顯著高于其他4個品種；白骨大葉的最短，為8.14 cm，顯著低于其他5個品種的（P＜0.05）。隨著大氣鎘沉降量的增加，除柳葉外，其他5個空心菜品種的根長均受到不同的抑制，尤以白骨大葉、白骨柳葉和特選泰國的最為明顯，都與D0處理間差異顯著（圖2C，P＜0.05）。值得一提的是，大氣鎘沉降量刺激了柳葉空心菜根的生長；在D18處理時，柳葉和特選泰國的根長顯著高于白骨大葉的。可見，6個品種空心菜種子發芽的根長對大氣鎘沉降量都比較敏感。

由圖2D可知，D0處理下，正宗三叉種子發芽鮮質量為0.27 g，顯著高于其他5個品種，且這5個品種鮮質量間無顯著差異（P＞0.05）。隨著鎘沉降量的增加，白骨大葉和白骨柳葉的鮮質量受到一定的抑制，特選泰國則先增加后降低，柳葉、雙機竹葉和正宗三叉受到不同程度的刺激而增重。方差分析發現，同一品種下，白骨大葉D9處理的鮮質量顯著低于D0處理，白骨柳葉D18處理顯著低于其他3個處理，柳葉D18處理顯著高于D0處理，特選泰國D18處理顯著低于D9處理，雙機竹葉和正宗三叉各處理間無顯著差異；不同品種下，D0和D3處理各品種的鮮質量無明顯差異，而D9處理下白骨大葉和白骨柳葉的鮮質量顯著低于其他4個品種，D18處理下白骨柳葉的鮮質量最低且顯著低于其他品種（特選泰國品種除外）。可見，大氣鎘沉降量對雙機竹葉和正宗三叉種子發芽的鮮質量影響較小，而對白骨柳葉和柳葉則相對較大。

2.3 模擬大氣鎘沉降量對空心菜種子發芽指數和活力指數的影響

模擬大氣鎘沉降量對6個品種空心菜種子的發芽指數和活力指數的影響見圖3。從圖3A可知，柳葉空心菜的發芽指數最大（10.89～12.11），白骨大葉空心菜的發芽指數最小（3.31～4.30），可見柳葉空心菜種子發芽能力較強而白骨大葉的較弱。隨著鎘沉降量的增加，白骨柳葉和正宗三叉種子的發芽指數變化差異不顯著（P＞0.05）；柳葉、雙機竹葉和白骨柳葉的發芽指數呈現先增后降的趨勢，且雙機竹葉D3處理和柳葉D9處理均顯著高于D0處理（P＜0.05），而白骨大葉的變化趨勢卻與此相反；正宗三叉種子的發芽指數呈現增?降?增的趨勢，而特選泰國種子的則與此相反。可見，白骨大葉、柳葉和雙機竹葉種子的發芽指數受鎘沉降量的影響較大，對環境的抗逆能力較弱。

由圖3B可知，6個品種空心菜種子發芽的根長活力指數的大小順序大致為柳葉＞特選泰國＞白骨柳葉＞正宗三叉＞雙機竹葉＞白骨大葉，可見柳葉空心菜種子的生長速度較快，白骨大葉則相反。D0處理下，白骨柳葉種子的根長活力指數最大（168.10），而白骨大葉的最小（28.89），且各品種間差異顯著（P＜0.05）。隨著鎘沉降量的增加，白骨柳葉和特選泰國的根長活力指數顯著下降，雙機竹葉的波動下降，而柳葉的則顯著上升，白骨大葉的先顯著下降后顯著上升，正宗三叉的在D3時達到最大且與其他3個處理差異顯著。可見，白骨柳葉、特選泰國和柳葉的根長活力指數受鎘沉降量的影響較大，白骨柳葉和正宗三叉受低鎘沉降量的影響較大，而雙機竹葉受影響則相對較小。

從圖3C可知，柳葉的種子發芽鮮質量活力指數最高（2.07～2.75），白骨大葉的最低（0.59～0.89）。隨著鎘沉降量的增加，白骨柳葉、特選泰國和正宗三叉種子鮮質量活力指數的變化差異不顯著，柳葉顯著增加，雙機竹葉在D3時最大，且與D0處理間差異顯著（P＜0.05）。可見，大氣鎘沉降量對柳葉和雙機竹葉種子發芽的鮮質量活力指數影響較大，且低水平鎘沉降量對雙機竹葉的影響顯著，而對其他品種的影響不顯著，說明柳葉和雙機竹葉種子對大氣鎘沉降量變化的抗逆能力較弱。

2.4 不同品種空心菜種子的發芽動力學研究

模擬大氣鎘沉降量處理下不同品種空心菜種子的發芽動力學趨勢大致符合“S”曲線，第1～3 d處于指數期，第3～4 d處于線性期，第4～7 d處于穩定期，見圖4。D0處理下，白骨大葉和雙機竹葉比其他品種晚1 d進入線性期，說這兩個品種的種子發芽較晚；白骨柳葉、特選泰國和正宗三叉比其余品種早1 d進入穩定期，說明這3個品種的種子發芽時間較短。鎘沉降量處理下，白骨大葉在第2～3 d的發芽動力學曲線的斜率大于D0處理，此現象也發生在柳葉、雙機竹葉及D18處理正宗三叉的第2～4 d，說明鎘沉降量促進了這4種空心菜的發芽速度；D3處理延遲白骨大葉和白骨柳葉的發芽時間至第5 d（圖4A、圖4B），延遲雙機竹葉和泰國的至第7 d（圖4D、圖4E）；D18處理提早柳葉和雙機竹葉的發芽時間至第5 d（圖4C、圖4D）；D9基本與D0相似，說明低水平鎘沉降量（D3）可延遲白骨大葉、白骨柳葉、雙機竹葉和泰國空心菜種子的發芽時間，高水平鎘沉降量（D18）可提早2 d柳葉和雙機竹葉的發芽時間。

2.5 模擬大氣鎘沉降量與空心菜種子發芽指標的關聯性分析

模擬大氣鎘沉降量與空心菜種子發芽指標的相關性，結果見表2。由表2可知，大氣鎘沉降量與空心菜種子發芽指標的相關性受品種的影響較大。鎘沉降量分別與白骨柳葉種子發芽的平均鮮質量、根長活力指數和鮮質量活力指標間呈顯著負相關，與正宗三叉的平均根長呈顯著負相關，而與柳葉的發芽勢、發芽指數、平均根長和根長活力指數呈顯著正相關（P＜0.05），與其他品種的種子發芽指標間無顯著相關（P＞0.05）。可見，大氣鎘沉降量主要是通過影響根的生長而作用于種子的發芽，分別抑制和促進了白骨柳葉和柳葉種子的發芽，而對其他4個品種的影響較小。

3 討論

種子的萌發是植物生命的起點，種子發芽的情況直接決定植物后期生長的狀況，而研究脅迫條件下種子發芽，可在一定程度上為植物環境的適應性提供理論依據[38，40]。本研究通過模擬大氣鎘沉降量進行6種空心菜種子發芽實驗發現：柳葉的發芽情況最好，日發芽數、發芽率、發芽指數及兩種活力指數均最高，說明其不僅發芽快、均勻，而且種子的活力也較好，但其受大氣鎘沉降量的影響較大；其次是泰國和白骨柳葉空心菜，除了白骨柳葉的發芽勢顯著高于其余5個品種外，二者的各項指標均相差較小，這與朱麗霞[38]和李富榮等[39]的研究結果相似；白骨大葉的發芽情況最差，其各項指標均最低，這可能是因為白骨大葉種子活力較弱；雙機竹葉空心菜雖然對鎘沉降量比較敏感，但其發芽情況較差；正宗三叉空心菜種子則對鎘沉降量敏感性最弱，這可能與不同品種空心菜的特性有關。

隨著大氣鎘沉降量的增加，白骨大葉的發芽勢、白骨柳葉的發芽勢、發芽指數和鮮質量活力指數、柳葉的發芽率、雙機竹葉的鮮質量、特選泰國的發芽勢和發芽率及正宗三叉的發芽率、鮮質量、發芽指數和鮮質量活力指數沒有顯著差異，這可能是因為上述空心菜種子在發芽前期主要依靠自養，外界重金屬離子大部分被阻止在種皮層，不能進入種子內部，從而對其影響較小[41]。柳葉的發芽勢及兩種活力指數均呈現逐漸增加的趨勢，且其平均根長和鮮質量及發芽指數均高于D0處理，這可能是因為鎘的濃度較低，低鎘對柳葉空心菜起到了促進作用。特選泰國的平均根長及根長活力指數呈現出逐漸減少的趨勢，說明重金屬鎘會抑制根的生長，這與先前的研究相似[42?46]，可能是因為鎘離子抑制種子內儲藏的淀粉和蛋白質分解，從而影響種子發芽所需的物質和能量，致使種子發芽受阻[47]。但特選泰國的平均鮮質量和鮮質量活力指數卻出現先增加后減少的趨勢，這與李富榮等[39]的研究結果不同，可能是因為種子吸水發芽時，胚根最先突破種皮，使其重金屬的積累量較大，受脅迫時間較長，所以對根長的抑制作用較為明顯，而鮮質量受到的影響較小，表現為先促進后抑制的作用；本研究設置的鎘沉降量與李富榮等[39]的不同，所以研究結果有所不同。白骨柳葉的發芽率、平均鮮質量、發芽指數及鮮質量活力指數呈現出先增加后減少的趨勢，這與朱麗霞等[38]和祝社民[48]的研究相似，可能是因為低濃度的鎘會促進空心菜的發芽，而高濃度的鎘抑制空心菜的發芽；其根長和根長活力指數顯著低于D0處理，與泰國空心菜相似，可能是因為這兩個品種的根長均受到沉降鎘的抑制作用，而根長活力指數與根長相關，所以也降低。雙機竹葉在D3和D18處理下的發芽勢及3個鎘沉降量下的根長均顯著低于D0，但D3處理下的發芽率、發芽指數和鮮質量活力指數卻顯著高于對照，這說明與其他指標相比，根長對外界環境的改變比較敏感，且“低促高抑”在此也有體現，這與特選泰國空心菜的結果相似。

表2 大氣鎘沉降量與不同品種空心菜種子發芽指標的相關性Table 2 Correlations of atmospheric Cd deposition flux and various parameters of water spinach seed germination

種子發芽是種子從吸脹作用開始的一系列有序的生理過程和形態發生過程[42]，這是一個動態的變化過程，因此，進行發芽動態分析是非常有意義的。從6個品種的發芽動力學曲線來看，空心菜在第2～4 d時是發芽快速期，且大部分品種是在D9和D18處理時發芽速度較快，這可能是因為鎘會促進植物體內淀粉酶、過氧化氫酶等酶活性的表達，促進可溶性蛋白質的合成，可溶性蛋白質可增加細胞內含物滲透勢，還能與重金屬形成復合物，降低重金屬的毒害效應，進而促進種子的發芽[25，49?50]。低劑量的鎘沉降會延遲空心菜種子的發芽時間，高劑量的鎘沉降可提早2 d柳葉和雙機竹葉的發芽時間，這可能是因為低鎘沉降量會促進種子體內各種功能酶的合成，使其發芽時間延長，高鎘沉降量則正相反[50]。鎘對空心菜的毒害機理主要是破壞線粒體和葉綠體，導致呼吸、光合作用減弱，葉片發黃，生物量下降[51]。為研究鎘沉降量對空心菜的毒害作用，本研究統計了6 d的爛根率，結果如表3所示。由表可知，鎘沉降量對白骨柳葉和特選泰國空心菜的影響較大，而對柳葉和正宗三叉的爛根率沒有顯著影響（P＞0.05），這可能是因為前者對鎘沉降量的變化較敏感，重金屬鎘進入植物根系后，會抑制根系透根電位和根系H+分泌及質子泵，根系的質子泵為細胞膜上的ATP酶所催化，是陰陽離子透過質膜的次級運轉的動力來源，因而鎘通過影響根系對陰陽離子的吸收平衡來影響根系代謝，從而導致爛根[52]。相關性分析發現，鎘沉降量與白骨大葉和雙機竹葉種子的爛根率呈負顯著相關（P＜0.05，表2），可能是因為二者對環境的抗逆能力較強。綜上所述，說明鎘沉降量對白骨柳葉和泰國種子發芽的影響時間較長，影響作用較強。這可能是因為重金屬對植物的毒害效應隨植物本身特性的不同而變化，且隨脅迫時間的延長，受到毒害作用的程度也有所不同[53]。

表3 不同空心菜種子的爛根率Table 3 Root rotten rate of different water spinach seeds

本研究的時間較短，沒有涉及到種子發芽后幼苗的生長與生理。因此，在后期的研究中，有必要在本研究的基礎上，再針對這些空心菜品種進行更深入的研究，以探討大氣鎘沉降在空心菜體內的轉移和累積機制，從而挑選出既滿足環境友好，又產量高、品質好的空心菜品種。

4 結論與展望

通過大氣鎘沉降的3個通量梯度的恒溫恒濕模擬，發現南京市場6個品種主流空心菜種子的發芽響應有一定的差異。

（1）大氣鎘沉降量通過影響種子根發育而影響其種子發芽情況，尤以白骨柳葉和柳葉受影響明顯。大氣鎘沉降量與白骨柳葉種子的平均鮮質量、根長活力指數和鮮質量活力指數呈顯著負相關，與柳葉的發芽勢、發芽指數、平均根長和根長活力指數呈顯著正相關，而與其他4個品種的發芽指標無明顯相關性（正宗三叉的平均根長除外）。

（2）大氣鎘沉降量與白骨大葉和雙機竹葉種子發芽的爛根率呈顯著負相關，說明大氣鎘沉降量的增加可緩解這兩個品種的爛根率。

（3）發芽動力學分析表明低劑量的鎘沉降量會延遲除柳葉和正宗三叉種子外其余品種的發芽時間，而高劑量的則提早柳葉和雙機竹葉2 d的發芽時間。