ZIF-8原位自封裝固定化脂肪酶的研究

梁鑫，張成楠*，周威，李秀婷，4，萬澄瑩

（1.北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京工商大學，北京100048；2.北京工商大學食品與健康學院，北京100048；3.北京工商大學理學院，北京100048；4.北京市食品添加劑工程技術研究中心，北京工商大學，北京100048）

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一類絲氨酸水解酶，能夠催化酯鍵斷裂和形成，參與轉酯、酯化和酯交換等多種反應。在食品工業中，脂肪酶因其催化效率高、反應條件溫和等優點廣泛應用于酯類化合物合成、油脂改性、以及酒和其它飲料的風味改善等領域[1-4]。游離脂肪酶的化學穩定性和熱穩定性差、成本高、且無法循環利用，利用物理或化學方法將游離酶結合到惰性載體上轉變成固定化酶，可以有效改善酶的穩定性，提高酶的催化壽命和回收率等，并可降低成本，擴大其工業應用范圍[5-6]。然而，尋找適合于脂肪酶的生物相容性載體和合適的固定化方法，在保護酶不失活且可重復回收利用的同時，還能最大程度上保證酶的催化活性，卻一直是個挑戰。

近年來，新型功能多孔材料的研究方興未艾，由于金屬有機框架（metal-organic frameworks，MOFs）多孔結構材料具有比表面積大、孔隙率高、孔道可調控性、易功能化及易修飾性等獨特的性能優勢受到了廣泛的關注，利用MOFs 材料制備固定化酶已成為研究熱點[7]。基于MOFs 材料，研究者通常采用表面吸附法、共價交聯法、孔隙封裝法和原位自封裝法（也稱原位封裝法）4 種手段制備固定化脂肪酶[8-9]。表面吸附法和共價交聯法主要通過氫鍵、共價鍵等將酶分子固定于MOFs 載體表面，這兩種方法存在酶分子易于脫落，機械穩定性差或者酶的構象改變造成酶活力降低等問題。孔隙封裝法和原位自封裝法是將酶分子封閉在MOFs 內部，給酶分子“穿上”MOFs“盔甲”，借助MOFs材料的剛性框架，有效地提升酶的穩定性，兩種方法的不同之處在于，孔隙封裝法通過直接將脂肪酶分子與已合成的MOFs 載體混合，使脂肪酶分子穿過MOFs孔道進入載體內部制備固定化酶；原位自封裝法是通過將酶分子加入MOFs 載體合成的反應液中，在自組裝形成載體的同時，直接把酶分子封閉到了MOFs 內部[8-9]。研究表明，在穿過MOFs 表面孔道被包裹進載體內部的過程中，酶分子的構象會發生不可逆的“展開”，導致其變性失活[10]。因此，更多的研究者將目光聚焦于使用原位自封裝法制備MOFs 固定化脂肪酶。目前，研究人員利用不同MOFs 材料原位封裝不同來源的脂肪酶成功制備了十余種固定化脂肪酶[11-17]。

研究發現，利用原位自封裝法制備的固定化酶的形貌和活性受到多種因素的影響，如金屬離子和有機連接體的濃度、酶的濃度等[9]。沸石-咪唑框架-8（zeolitic imidazolate framework-8，ZIF-8）是以Zn2+和咪唑連接體通過配位鍵自組裝形成的一種MOFs 材料[7]。Cui 等[18]研究發現通過改變硝酸鋅和2-甲基咪唑的濃度和比例可以使ZIF-8 構象由菱形十二面體形狀改變成十字花形狀，利用十字花形狀的ZIF-8 原位封裝過氧化氫酶制備的固定化酶的活性比菱形十二面體形狀的固定化酶提高了400%。Pitzalis 等[16]研究了硝酸鋅和2-甲基咪唑摩爾比（Zn/M）不同對固定化脂肪酶的影響，結果表明，在Zn/M=1∶4 條件下制備的固定化脂肪酶比在Zn/M=1∶40 條件下制備的固定化脂肪酶具有更高的負載量和比活性。Qi 等[13]研究發現原位自封裝法制備的固定化脂肪酶的水解效率隨酶濃度增加而提高，然而負載率隨酶濃度增加而下降。對于固定化載體MOFs 材料，金屬離子的來源、反應時間等因素都會影響其形貌[19]，然而這些因素對固定化脂肪酶影響的研究相對較少。

本研究采用ZIF-8 材料原位自封裝皺褶假絲酵母源脂肪酶（Candida rugosa lipase，CRL）制備固定化脂肪酶（CRL@ZIF-8），探討了金屬離子來源、反應時間、金屬離子濃度和有機連接體的濃度等因素對固定化酶催化活性和形貌特征的影響，并比較了游離酶與固定化酶的溫度耐受性。

1 材料與方法

1.1 材料

皺褶假絲酵母脂肪酶（CRL）、硝酸鋅、2-甲基咪唑、醋酸鋅、對硝基苯丁酸酯（p-nitrophenylbutyrate，PNPB）：美國Sigma-Aldrich 公司；正庚烷；美國Meridian Medical Technologies 公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津市天力化學試劑有限公司。

1.2 儀器

Himac 多用途冷凍離心機（CF-RN 系列）、掃描電子顯微鏡（SU8010）：日本Hitachi Koki 公司；高速組織勻漿機（T 10 basic）：德國IKA 公司；真空冷凍干燥機（Free zone 4.5 plus）：美國Labconco 公司；傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet IS50）：賽默飛世爾科技有限公司；桌面型多晶X 射線衍射儀（D2 PHASER）：德國布魯克AXS 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 脂肪酶的固定化

參考Cui 等[18]關于固定化過氧化氫酶的制備方法并做適當修改。將20 mL 1 mol/L 2-甲基咪唑溶液與80 mg CRL 混合均勻，然后加入2 mL 0.5 mol/L 醋酸鋅溶液，在300 r/min 下反應30 min。反應結束后，用去離子水洗滌沉淀物3 次，收集沉淀，冷凍干燥（-80 ℃，12 h），得到固定化脂肪酶CRL@ZIF-8。以在相同條件下不添加酶制備的ZIF-8 作為空白對照。

1.3.2 固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 酶活力的測定

固定化脂肪酶的酶活測定方法參考QIL 等的方法并做適當修改[13]。稱取0.01 g CRL@ZIF-8，加入1 mL 0.01 mol/L 的溶于正庚烷中的PNPB 溶液和1 mL 0.01 mol/L（pH 7.5）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS），在13 000 r/min 均質30 s，再在200 r/min條件下振蕩反應5 min。反應結束后，加入0.5 mol/L Na2CO3終止反應，4 ℃下離心收集上清液，在405 nm下測定吸光值。一個酶活力單位定義為：每分鐘釋放1 μmol 對硝基苯酚（p-nitrophenol，p-NP）所需的固定化酶的酶量，以U/g 表示。

1.3.3 固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 結構表征

稱取一定量的CRL@ZIF-8 樣品，研磨至均勻粉末，使用傅里葉變換衰減全反射紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）分析結構組成，掃描范圍為400 cm-1～4 000 cm-1；使用X-射線衍射（Xray diffraction，XRD）分析晶體結構，掃描的角度范圍為5°～45°，掃描時間為0.07 s；采用掃描電鏡（scanning electron microscopy，SEM）分析樣品形貌。

1.3.4 脂肪酶固定化條件的選擇

采用1.3.1 脂肪酶CRL 的固定化方法，分別考察金屬離子來源、反應時間、金屬離子和有機連接體的濃度對CRL@ZIF-8 形貌結構和催化活性的影響，并以固定化酶酶活力為指標，篩選最佳的固定化條件。

1.3.5 固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 的溫度耐受性研究

稱取一定量的CRL@ZIF-8，加入0.01 mol/L 的PBS 緩沖液中，在50 ℃下水浴振蕩，分別在0、10、20、30、45、60 min 測定酶活力。設置0 min 的酶活力為100%，分別計算在不同時間固定化酶的剩余酶活力。

2 結果與分析

2.1 脂肪酶固定化條件的選擇

2.1.1 不同金屬鹽對CRL@ZIF-8 的結構和催化活性的影響

ZIF-8 由Zn2+和咪唑基連接體自組裝合成，目前文獻中報道的用于合成固定化脂肪酶CRL@ZIF-8 的Zn2+供體主要包括硝酸鋅和醋酸鋅等[11-17]，然而不同Zn2+供體對固定化脂肪酶的影響尚不清楚。本研究考察了利用相同濃度的硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 的差異，結果如圖1、圖2 和圖3 所示。圖1為利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 和CRL 的FT-IR 譜圖。

由圖1a 可見，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）和CRL@ZIF-8（醋酸鋅）均在420 cm-1處出現ZIF-8 的Zn-N 鍵的伸縮振動吸收峰，在692 cm-1和758 cm-1處出現咪唑環的平面外彎曲特異吸收峰，在953 cm-1和1 308 cm-1處出現咪唑環的平面內彎曲特異吸收峰，在2 930 cm-1和3 124 cm-1處出現咪唑的脂肪族和芳香族的C-H鍵的伸縮振動吸收峰，這些特異吸收峰與文獻中報道的ZIF-8 的特異吸收峰一致[12-13]；CRL@ZIF-8（硝酸鋅）、CRL@ZIF-8（醋酸鋅）和CRL 均在1 600 cm-1～1 700 cm-1處出現蛋白質的酰胺鍵的特異吸收峰，將1 500 cm-1～2 000 cm-1位置局部放大，由圖1b 可見，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）和CRL@ZIF-8（醋酸鋅）的酰胺鍵的特異吸收峰相比于CRL 出現了輕微的偏移，這可能是因為ZIF-8 結構中的Zn2+與脂肪酶分子中的羰基間的相互作用引起酰胺鍵的特異吸收峰發生變化[13]。上述研究結果從官能團方面表明成功制備出了CRL@ZIF-8。

圖2 為利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8的XRD 譜圖。

圖1 不同金屬鹽制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.1 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized by employing different zinc salt

圖2 不同金屬鹽制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.2 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized by employing different zinc salt

由圖2 可見，CRL@ZIF-8（醋酸鋅）在2θ=7.29°、10.31°、12.66°、14.64°、16.41°、17.99°、22.08°、24.43°、25.54°、26.63°、29.61°、30.56°的位置觀察到衍射峰，與ZIF-8 的標準XRD 譜圖基本一致[13，15]。CRL@ZIF-8（醋酸鋅）與ZIF-8 衍射峰分布規律一致，表明固定化脂肪酶CRL 對ZIF-8 的晶體結構沒有顯著的影響。相比較于CRL@ZIF-8（醋酸鋅）和標準的ZIF-8 結構，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）的衍射峰分布規律顯著不同。Biemmi 等[19]研究表明，利用硝酸鋅合成的MOF-5 晶粒較大，而利用醋酸鋅合成的MOF-5 晶粒較小。這可能是由于與硝酸鋅相比，醋酸鋅的堿性更強。相比于以硝酸鋅作為Zn2+供體，以醋酸鋅作為Zn2+供體合成MOF 過程中的初始成核率更高[19]。

圖3 為利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8的酶活力。

圖3 不同金屬鹽制備的CRL@ZIF-8 的酶活Fig.3 The enzymatic activity of CRL@ZIF-8 synthesized by employing different zinc salt

固定化脂肪酶催化對硝基苯丁酸酯（PNBP）水解產生對硝基苯酚（p-NP），對硝基苯酚在405 nm 處有紫外吸收，因此可通過吸光值的變化來測定固定化脂肪酶的酶活[20]。

由圖3 可見，CRL@ZIF-8（硝酸鋅）比CRL@ZIF-8（醋酸鋅）催化對硝基苯丁酸酯（PNPB）水解的能力更強。然而，通過對利用硝酸鋅或醋酸鋅制備的ZIF-8 研究發現，ZIF-8 也具有一定的催化PNPB 水解的能力，并且ZIF-8（硝酸鋅）比ZIF-8（醋酸鋅）催化PNPB 水解的能力更強，其原因有待探討。除去ZIF-8 催化PNPB 的水解作用，可以觀察到由醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 催化底物水解的活性強于由硝酸鋅制備的CRL@ZIF-8。綜上所述，選擇醋酸鋅進行后續試驗。

2.1.2 不同反應時間對CRL@ZIF-8 的結構和催化活性的影響

基于ZIF-8 材料利用原位自封裝法合成固定化酶的反應時間對催化性能有重要影響[11-17]。本研究考察了ZIF-8 原位封裝CRL 制備固定化酶CRL@ZIF-8 的反應時間對其結構和催化活性的影響，結果如圖4、圖5 和圖6 所示。

圖4 不同反應時間制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.4 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized at different reaction times

由圖4 可見，當反應時間從10 min 增加到30 min時，CRL@ZIF-8 在420、692、758、953、1 308、1 651、2 930、3 124 cm-1處出現的特異吸收峰沒有顯著差異，從官能團方面表明反應時間對CRL@ZIF-8 的結構沒有顯著影響。

圖5 不同反應時間制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.5 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized at different reaction times

由圖5 可見，當反應時間從10 min 增加到30 min時，CRL@ZIF-8 的衍射峰分布規律一致，表明反應時間對CRL@ZIF-8 的晶體結構沒有顯著影響。

圖6 不同反應時間制備的CRL@ZIF-8 的酶活Fig.6 The enzymatic activity of CRL@ZIF-8 synthesized at different reaction times

由圖6 可見，隨著反應時間逐漸增加，CRL@ZIF-8 的酶活力逐漸提高，ZIF-8 原位封裝CRL 30 min 制備的固定化酶的酶活力比反應10 min 制備的固定化酶的酶活力提高了260%。這可能是由于隨著反應時間的增加，ZIF-8 載體的固載率上升。Biemmi 等[19]研究表明，隨著反應時間增加，HKUST-1 的產率逐漸增加，而其晶體結構未發生改變。反應時間超過30 min 對CRL@ZIF-8 酶活力的影響有待于進一步的研究探討。

2.1.3 2-甲基咪唑濃度對CRL@ZIF-8 的形貌結構和催化活性的影響

2-甲基咪唑濃度影響到ZIF-8 的形貌結構進而改變ZIF-8 的比表面積[20]。本研究考察了利用不同濃度的2-甲基咪唑制備的CRL@ZIF-8 的差異，結果如圖7、圖8、圖9 和圖10 所示。

圖7 不同2-甲基咪唑濃度制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.7 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized by using different 2-methylimidazole concentrations

FT-IR 分析表明，隨著2-甲基咪唑濃度的逐漸增加，ZIF-8 的特異吸收峰無顯著差異，而1 600 cm-1～1 700 cm-1處出現蛋白質的酰胺鍵的特異吸收峰逐漸減弱（圖7）。XRD 分析表明，CRL@ZIF-8 的衍射峰強度隨著2-甲基咪唑濃度的增加逐漸增強（圖8）。SEM分析表明，當2-甲基咪唑濃度為0.6 mol/L 時，大多數的CRL@ZIF-8 聚集成團，晶體形狀不規則；隨著2-甲基咪唑濃度逐漸增加，CRL@ZIF-8 逐漸分散，且形狀越來越規則，結塊現象消失；當2-甲基咪唑濃度為1.0 mol/L 時，CRL@ZIF-8 分散均勻，呈現標準的菱形十二面體的形態（圖9）。這些研究結果表明，2-甲基咪唑濃度對CRL@ZIF-8 的形貌結構具有顯著影響。Cui等[18]研究發現，通過改變2-甲基咪唑的濃度，ZIF-8 原位封裝過氧化氫酶制備的固定化酶catalase@ZIF 的形貌發生改變，從標準的菱形十二面體的形態改變為十字花形態。Qi 等[13]研究表明，在ZIF-8 原位封裝酶分子制備固定化酶的過程中，ZIF-8 材料并不是簡單地將酶分子“包裹住”，相反，ZIF-8 材料與酶分子間發生了復雜的相互作用。本研究中未發現相似的形態改變現象，可能是因為脂肪酶CRL 與過氧化氫酶的結構不同導致的。

圖8 不同2-甲基咪唑濃度制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.8 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized by using different 2-methylimidazole concentrations

圖9 不同2-甲基咪唑濃度制備的CRL@ZIF-8 的SEM 圖Fig.9 The SEM images of CRL@ZIF-8 synthesized by using different 2-methylimidazole concentrations

通過對不同2-甲基咪唑濃度條件下制備的CRL@ZIF-8 的催化活力研究表明，隨著2-甲基咪唑濃度從0.6 mol/L 增加到1.0 mol/L，CRL@ZIF-8 催化PNPB 水解的能力逐漸增強（圖10）。CRL@ZIF-8 的酶活力增強可能是由于隨著2-甲基咪唑濃度的提高，CRL@ZIF-8 的晶體形狀逐漸規則，分散均勻，從而使得底物傳遞阻力減小，底物更容易接近酶的催化中心，從而提高了催化效率。這些研究結果證實了2-甲基咪唑濃度對CRL@ZIF-8 的形貌結構和催化活性具有重要的調控作用。

2.1.4 醋酸鋅濃度對CRL@ZIF-8 的形貌結構和催化活性的影響

一般地講，改變Zn2+供體濃度可以調控固定化酶的形貌結構和催化活性[18]。本研究考察了利用不同濃度的醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 的差異，結果如圖11、圖12、圖13 和圖14 所示。

FT-IR 分析表明，隨著醋酸鋅濃度從0.5 mol/L 逐漸增加1.0 mol/L，CRL@ZIF-8 的特異吸收峰無顯著差異（圖11）；XRD 分析表明，不同濃度的醋酸鋅制備的CRL@ZIF-8 的衍射峰分布和強度基本一致（圖12）；SEM 分析表明，不同醋酸鋅濃度條件下，CRL@ZIF-8的形狀和大小沒有明顯的變化（圖13）。這些研究結果表明，在本研究的試驗條件下，醋酸鋅濃度對CRL@ZIF-8 的形貌結構沒有顯著的調控作用。

通過對不同醋酸鋅濃度條件下制備的CRL@ZIF-8 的催化活力研究發現，隨著醋酸鋅濃度從0.5 mol/L增加到1.0 mol/L，CRL@ZIF-8 的酶活力降低（圖14）。這可能是由于在CRL@ZIF-8 的自組裝過程中，高濃度的醋酸鋅影響了脂肪酶分子CRL 的結構，導致了固定化酶催化活性的下降[13]。

圖11 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的FT-IR 圖Fig.11 FTIR spectra of CRL@ZIF-8 synthesized by using different zinc acetate concentrations

圖12 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的XRD 圖Fig.12 XRD patterns of CRL@ZIF-8 synthesized by using different zinc acetate concentrations

圖13 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的SEM 圖Fig.13 The SEM images of CRL@ZIF-8 synthesized by using different zinc acetate concentrations

圖14 不同醋酸鋅濃度制備的CRL@ZIF-8 的酶活Fig.14 The enzymatic activity of CRL@ZIF-8 by using different zinc acetate concentrations

綜合分析上述研究結果，通過探究不同金屬鹽、反應時間、2-甲基咪唑和醋酸鋅濃度對CRL@ZIF-8的影響，確定了合成CRL@ZIF-8 的條件：反應時間為30 min，2-甲基咪唑濃度為1.0 mol/L，醋酸鋅濃度為0.5 mol/L。

2.2 CRL@ZIF-8 的溫度耐受性

通過ZIF-8 載體原位自封裝酶分子制備的固定化酶，可以借助ZIF-8 結構的剛性框架，有效地提升酶的穩定性[9-10]。本研究考察了CRL@ZIF-8 的溫度耐受性，結果如圖15 所示。

由圖15 可知，分別將游離脂肪酶和固定化脂肪酶在50 ℃條件下保育30 min 后，游離脂肪酶CRL 的相對剩余酶活為48%，而CRL@ZIF-8 在30 min 時的相對剩余酶活為97%；保育60 min 后，游離脂肪酶CRL 的相對剩余酶活為43%，而CRL@ZIF-8 的相對剩余酶活為94%。因此，脂肪酶CRL 經過固定化之后，溫度耐受性得到了顯著提升。

圖15 游離酶CRL 和固定化酶CRL@ZIF-8 的溫度耐受性Fig.15 The temperature tolerance of CRL and CRL@ZIF-8

3 結論

本研究采用ZIF-8 材料原位自封裝皺褶假絲酵母源脂肪酶（CRL）制備固定化脂肪酶（CRL@ZIF-8），研究了金屬離子來源、反應時間、金屬離子和有機連接體的濃度等因素對固定化酶催化活性和形貌特征的影響。結果表明，在反應時間為30 min，2-甲基咪唑濃度為1.0 mol/L，醋酸鋅濃度為0.5 mol/L 時，合成的CRL@ZIF-8 酶活力最高，達到9.8 U/g。通過比較游離酶和固定化酶的溫度耐受性，發現固定化后的脂肪酶CRL@ZIF-8 的溫度穩定性有較大提升。