研磨對豌豆分離蛋白應用特性的影響

劉巧珍，代養勇*，侯漢學，王文濤，丁秀臻，張慧，董海洲

（1.山東農業大學食品科學與工程學院，山東泰安271018；2.山東省糧食加工技術工程技術研究中心，山東泰安271018）

目前很多研究表明：過多攝入動物蛋白會增加冠心病等的患病概率，導致低脂、低熱量的植物源蛋白的需求增大[1-2]。目前我國豌豆加工的重點是制備豌豆淀粉，豌豆蛋白為其副產品[3]。由于豌豆蛋白在加工過程中易變性，持水性差，起泡性和乳化性也不太理想，導致豌豆蛋白研究與開發不足，隨之絕大部分豌豆蛋白作為飼料，造成了蛋白質資源的極大浪費[4-5]。因此，需要改善豌豆蛋白的應用特性，擴大其在食品工業的應用。

目前，蛋白性質主要是通過物理法、化學法和酶法等方法來改善[6]。其中，物理法簡單、環保，且安全性高。研磨作為一種有效的物理改性手段，可以制備一些新材料。研磨通過機械力（摩擦、撞擊等）克服顆粒的內聚力，使物料破碎；同時，研磨過程中產生的反復高能量沖擊造成機械力化學效應，會引起物料性質的變化[7-8]。在食品加工領域，學者多數采用濕法來改善蛋白性質。吳迪等[9]采用高壓均質改善櫛孔扇貝蛋白乳化特性。孫靖辰等[10]則利用超聲提高米糠蛋白的溶解度、凝膠性等功能特性。關于干法改善蛋白性質的報道很少，干法處理后無需干燥、能耗低，比濕法處理更易在工業中推廣。

本文采用研磨技術干法處理豌豆分離蛋白，研究研磨后豌豆分離蛋白顆粒形態結構、親水基團、疏水基團、持水性、持油性、泡沫特性、乳化性能、凝膠性能等結構與應用特性的變化，并通過分析親水（油）性與應用特性的相關性，探討研磨對豌豆分離蛋白顆粒的作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料

豌豆分離蛋白：雙塔食品有限公司；尼羅紅：阿拉丁工業公司；一級大豆油：市售；溴化鉀（KBr）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）：西格瑪化學公司；所用化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器

ST-Q200 行星式球磨機：北京旭鑫儀器設備有限公司；JSM-6510LV10800 鎢燈絲掃描電子顯微鏡：日本JEOL 公司；JC2000C1 型接觸角測量儀：上海中晨數字技術設備有限公司；TG1650-WS 臺式高速離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UV-8000A 紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；TA.XTC 質構儀：上海保圣實業發展有限公司；T18 digital Ultra-T高速分散器：德國IKA 公司。

1.3 豌豆蛋白研磨處理

用研磨機研磨豌豆分離蛋白。其中球與樣品質量比為5∶1。機器在室溫25 ℃下，以200 r/min 的轉速運行。其中每隔2.5 min 停止儀器運行1 h，并將研磨罐水浴冷卻，以減少研磨過程中熱量的產生。研磨結束后樣品放入自封袋中，4 ℃保存。

1.4 掃描電鏡

使用離子噴射器在樣品表面鍍一層15 nm 左右的金箔后（豌豆蛋白樣品經過離子濺射儀噴金后），在工作距離5.1 mm，加速電壓6 kV，放大倍數1 000 條件下通過掃描電鏡進行觀察并拍攝[11]。

1.5 接觸角的測定

取適量豌豆蛋白樣品用壓片機壓成光滑的薄片，選用去離子水、大豆油作為潤濕性試驗液體，通過接觸角測定儀采用懸滴法依次測定液滴與樣品表面的接觸角。

1.6 應用特性的測定

1.6.1 持水性的測定

持水性根據耿軍鳳等的方法[12]，略有改動。準確稱取0.1 g 豌豆蛋白樣品置于離心管內后加入20 mL 蒸餾水，用玻璃棒將其攪均，隨后在80 ℃水浴中保溫60 min，取出冷卻。將冷卻至室溫（25℃）的樣品于3 000 r/min 下離心30 min，倒去上清液。測定此刻離心管加沉淀物的質量。持水性計算公式如下。

式中：W0為豌豆蛋白質量，g；W1為豌豆分離蛋白加離心管質量，g；W2為離心后離心管加沉淀物質量，g。

1.6.2 持油性的測定

準確稱取2.0 g 豌豆蛋白樣品置于離心管內加入10 mL 大豆油，用玻璃棒將其攪均，靜置30 min 后于3 000 r/min 離心30 min，倒去上清液。測定離心管與沉淀物的質量。持油性計算公式如下[13]。

式中：W0為豌豆蛋白質量，g；W1為豌豆分離蛋白加離心管質量，g；W2為離心后離心管加沉淀物質量，g。

1.6.3 起泡性和泡沫穩定性的測定

配制3%的豌豆蛋白質溶液，用氫氧化鈉或者鹽酸調節樣品pH 值至7.0，在30 ℃水浴下保溫10 min，然后用高速分散器在5 000 r/min 下均質3 min 后迅速倒入量筒中。記錄均質前溶液的體積，均質結束時泡沫的體積，均質結束10 min 的泡沫體積。起泡性（foaming characteristic，FC）和泡沫穩定性（foaming stability，FS）[14]計算公式如下。

式中：V 為均質前溶液的體積，mL；V0為均質結束時泡沫的體積，mL；V1為均質結束10 min 的泡沫體積，mL。

1.6.4 乳化性和乳化穩定性的測定

采用比濁法測定乳化特性。配制1 mg/mL 的待測樣品以9∶1 的質量比加入大豆油，經高速分散器于10 000r/min 下均質2min，分別在攪拌后0min 和10min時從測試管底部取樣100 μL，用質量濃度為0.1 g/L 的SDS 稀釋50 倍后，測定樣品在500 nm 處的吸光度值，以SDS 溶液做空白[15]。乳化性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）的計算公式如下。

式中：DF 為稀釋倍數；C 為樣品濃度，g/mL；φ 為光程，φ=1 cm；θ 為乳液中油相所占比例；A0為0 min時測定的吸光度；A10為10 min 時測定的吸光度；t 為時間，t=10 min。

1.6.5 凝膠性的測定

將配制17%豌豆蛋白溶液放入磁力攪拌器中以1 500 r/min 攪拌60 min，隨后在90 ℃下水浴保溫30 min。取出冷卻在4 ℃冷藏過夜，制得豌豆蛋白凝膠[16]。在質構儀上測定其質構特性[17]。

1.7 數據分析

所有試驗均重復3 次，采用Origin 軟件進行圖表繪制。采用SPSS 軟件對數據進行ANOVA 差異顯著性分析，以P＜0.05 為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 研磨處理時間對豌豆分離蛋白質顯微結構的影響

豌豆蛋白的掃描電鏡圖見圖1。

圖1 豌豆蛋白的掃描電鏡圖Fig.1 Scanning electron micrograph of pea protein

由圖1 中可見，研磨處理后的豌豆分離蛋白形貌特征發生了明顯變化。豌豆分離蛋白原樣完整，表面平滑，粒徑較大，且分布比較集中，與XIONG 等[18]研究一致。當研磨2.5 min～7.5 min 時，部分豌豆分離蛋白破碎，顆粒粒徑開始變小，表面開始變得不平滑，部分顆粒表面黏附有碎片形成了聚集體（圖1 D）。隨著研磨時間的增加，蛋白質的結構嚴重破壞，顆粒粒徑明顯變小，顆粒碎片呈現出不規則、無序的形態，顆粒表面顯著粗糙、質地也明顯疏松。對蛋白的破壞越嚴重，碎片呈現出各種不規則、無序的形態，顆粒表面變粗糙，質地變得疏松。

2.2 研磨處理時間對豌豆分離蛋白質接觸角的影響

豌豆蛋白片表面的水接觸角光學照片見圖2，豌豆蛋白片表面的油接觸角光學照片見圖3。

蛋白質的親水性是指蛋白對水的親和能力，表面被水所潤濕的能力[19]。蛋白質的親/疏水性、潤濕性，對蛋白質的應用特性有重要的指導意義。本文通過去離子水、大豆油在豌豆蛋白表面形成的接觸角來表征親/疏水性、潤濕性。

圖2 豌豆蛋白片表面的水接觸角光學照片Fig.2 Optical photo of water contact angle on the surface of pea protein sheet

圖3 豌豆蛋白片表面的油接觸角光學照片Fig.3 Optical photo of oil contact angle on the surface of pea protein sheet

結合圖2、圖3 可看出，研磨后蛋白質的親水性增強，親油性降低。隨著研磨時間的延長，蛋白質的親水性呈現出現先升高后降低的趨勢。在研磨時間為7.5 min 時，蛋白質的親水性達到最大。這主要是由于短時間地研磨下，蛋白發生了團聚、折疊現象（圖1 D），減少了蛋白顆粒表面和間隙中的空氣含量，同時蛋白質內部的部分極性基團暴露出來，導致親水性得到了提高[20]。而當研磨時間過長時，顆粒結構嚴重破壞（圖1G），蛋白質結構中大量疏水基團暴露，同時蛋白粒徑的降低使得空氣容易在蛋白質的表面形成氣膜，這導致了水對蛋白質的潤濕性減弱，所以這時蛋白親水性減弱[21]。

2.3 研磨處理時間對豌豆分離蛋白質持水性的影響

研磨時間對豌豆蛋白持水性的影響見圖4。

圖4 研磨時間對豌豆蛋白持水性的影響Fig.4 The effect of grinding time on the water retention of pea protein

持水性是將水截留在組織內的能力[22]。由圖4 可知，研磨處理時間在2.5 min～7.5 min 時，蛋白質的持水性隨著研磨處理時間的延長而增大。研磨處理7.5 min時，豌豆分離蛋白的持水性達到最大為4.095 g/g，比原樣升高了37.4%。這可能是因為，短時間的研磨處理使蛋白分子伸展，極性基團暴露于表面，親水性增加，水分子能夠穩定的存在于蛋白結構中[23]。但是研磨超過7.5 min 時持水性降低，這是由于長時間研磨導致蛋白質結構嚴重破壞，降低了蛋白質與水結合的有效性，導致蛋白質的持水性下降。

2.4 研磨處理時間對豌豆分離蛋白質持油性的影響

研磨時間對豌豆蛋白持油性的影響見圖5。

圖5 研磨時間對豌豆蛋白持油性的影響Fig.5 The effect of grinding time on the oil retention of pea protein

持油性是指對油吸附并將油截留在組織內部的能力[24]。由圖5 可知，隨著研磨時間的延長，豌豆分離蛋白的持油性呈現先升高后降低的趨勢，在研磨時間為7.5 min 時，蛋白質的持油性達到最大。這可能是因為短時間研磨，蛋白質極性基團暴露導致部分疏水基團內埋，雖然親油性下降，但油滴可以穩定的存在于疏水基團的空隙中[25]。隨后蛋白質結構遭到嚴重破壞，與油結合的緊密性下降，持油性降低[26]。

2.5 研磨處理時間對豌豆分離蛋白質起泡特性的影響

良好的起泡特性可滿足食品加工的特殊需要，如蛋糕、啤酒等的加工。起泡性指在攪打的過程中，形成氣泡的能力[27]。起泡穩定性則指泡沫不被破損的能力[28]。研磨時間對豌豆蛋白溶液起泡性（FC）及起泡穩定性（FS）的變化影響如圖6 所示。

圖6 研磨時間對豌豆蛋白起泡特性的影響Fig.6 The effect of grinding time on the foaming characteristics of pea protein

由圖6 可知，隨著研磨時間的增大，豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩定性均呈現先增加后減小的趨勢，其中研磨時間為7.5 min 時，豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩定性均達到最大。原因是此時間內蛋白分子發生適度伸展，蛋白分子間能形成比較穩定的網絡結構和界面膜，同時蛋白質與水相互作用增強，使得蛋白的起泡性不斷增加[29]。當研磨時間大于7.5 min 時，豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩定性開始下降，這是由于豌豆蛋白變性嚴重，蛋白質分子間相互作用減弱；同時大量疏水基團的暴露使蛋白質親水、持水性下降，產生的泡沫界面膜缺乏韌性容易破裂，導致豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩定性開始下降[30]。

2.6 研磨處理時間對豌豆分離蛋白乳化性能的影響

研磨時間對豌豆蛋白乳化性能的影響見圖7。

圖7 研磨時間對豌豆蛋白乳化性能的影響Fig.7 The effect of grinding time on the emulsification of pea protein

乳化性能是蛋白質重要的功能特性之一。乳化性（EAI）表示蛋白乳液的形成能力，乳化穩定性（ESI）是蛋白乳液保持穩定的能力[31-32]。由圖7 可見，研磨處理能顯著提高豌豆分離蛋白的乳化性能，其中研磨時間為7.5 min 時具有最好的乳化性能，EAI 和ESI 達到17.14 m2/g 和122.33 min，分別比原樣提高了79.10%和49.42%。結果表明：適當的研磨處理會使蛋白質的空間結構適當分散，蛋白質分子適度伸展，部分內埋的極性基團和非極性基團暴露，蛋白質在油水界面更易吸附，蛋白質吸附到油-水分界處的速率得到提高，因此提高了豌豆分離蛋白的乳化性及乳化穩定性[33]。但長時間研磨后，蛋白質維持穩定空間結構的鍵遭到破壞，蛋白質發生嚴重變性，降低了蛋白質膜與油水界面的吸附力，使豌豆分離蛋白的乳化性和乳化穩定性下降[34]。在食品加工過程中，常常會出現乳化性不理想的問題，因此經過研磨處理的豌豆分離蛋白在食品行業中有較大的優勢。

2.7 研磨處理時間對豌豆分離蛋白質凝膠性能的影響

研磨時間對豌豆蛋白凝膠性能的影響見表1。

表1 研磨時間對豌豆蛋白凝膠性能的影響Table 1 Effect of grinding time on pea protein gel properties

受到外力作用變形除去作用力時，能恢復原來形狀的性質為彈性，在一定時間內的回復能力為回復性[35]。

由表1 可知，豌豆分離蛋白凝膠的彈性、回復性表現出相同的趨勢。隨著研磨時間延長，凝膠的彈性、回復性先增大后減小。研磨時間為7.5 min 時，凝膠的彈性、回復性達到最大。出現這種趨勢的原因是研磨時間的增大，使得蛋白質分子伸展，內埋基團暴露，蛋白質-蛋白質相互作用增加，促進形成凝膠網狀結構，彈性增大，回復性增大[36]。當研磨時間進一步延長時，蛋白質結構被破壞，隨之維持穩定凝膠網狀結構的鍵被破壞，因此彈性、回復性降低。

2.8 相關性分析

親水性、親油性與蛋白應用特性相關性分析見表2。

表2 親水性、親油性與蛋白應用特性相關性分析Table 2 Correlation analysis of hydrophilicity，lipophilicity and protein application characteristics

相關性分析表明，親水性對豌豆分離蛋白的應用特性影響趨勢一致，呈正相關，其中持水性、持油性、乳化特性、凝膠彈性表現出極顯著正相關。親水性對豌豆分離蛋白應用特性的影響表現為親水性越高，應用特性越好。親油性對豌豆分離蛋白的應用特性影響趨勢一致，呈負相關，其中乳化性表現出極顯著負相關，持油性表現出了顯著負相關。表明親油性對豌豆分離蛋白應用特性的影響表現為親油性越好，應用特性越差。

3 結論

研磨顯著提高了豌豆分離蛋白的親水性、持水性、持油性、起泡性和泡沫穩定性等應用特性；且乳化性能、凝膠性能也得到不同程度的提高。其中研磨7.5 min 時豌豆分離蛋白應用特性最佳。這些發現將有助于豌豆蛋白穩定乳液產品的研發。

在研磨作用下，豌豆蛋白的顆粒出現了聚集、團聚等類似機械力化學效應的現象。今后可將研磨與低劑量變性劑結合共同改性蛋白，提高其應用特性，開發更多的高性能豌豆分離蛋白產品。