熟地黃粗提物對光損傷小鼠視網膜的保護作用

劉瑩，劉垚杰，李麗維，周王誼，徐閻，王玥，徐詠全，王浩*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津300457；2.天士力研究院，天津300410）

長時間暴露在強光下會加速視網膜氧化應激，導致視網膜損傷[1]。視網膜內過量自由基的產生，是誘導氧化應激發生的重要因素[2]。王曉英等研究發現，強光會導致視網膜組織中產生過量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）[3]，導致體內氧化平衡體系失衡，從而導致視疲勞、白內障和年齡相關性黃斑變性等眼部疾病的發生[4-5]。此外，WANG 等研究發現，視網膜氧化受損會導致促炎細胞因子的過度表達，這也是導致視網膜損傷的重要因素[5]。

熟地黃，屬玄參科，是加工炮制而成的一種中藥材[6-7]。目前，已從熟地黃中分離出約70 種單體化合物，主要包括多糖、單糖、梓醇、水蘇糖和5-羥甲基糠醛等活性成分[6，8]。研究表明，水溶性多糖為熟地黃的主要活性成分，具有提高機體抗氧化力[9]、增強免疫力[10]、降血糖[11]、抗突變[12]和促進內皮細胞增殖[13]等作用；熟地黃中水蘇糖含量約為30%，具有較強的抗氧化能力[14]。梓醇是熟地黃中的一種功能活性成分，屬于環烯醚萜單糖苷類，并且具有緩解糖尿病視網膜病變的作用[15]。除此以外，熟地黃中還包括甘露醇、維生素A 等其它抗氧化活性成分[16]。本研究以光損傷小鼠為模型，通過視網膜電圖（electroretinogram，ERG）和光學相干斷層成像（optical coherence tomography，OCT）以及抗氧化和炎癥相關視網膜生理指標的檢測，探究熟地黃對視網膜損傷的保護作用，以期為熟地黃開發緩解視疲勞保健產品提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

實驗小鼠、基礎飼料：斯貝福（北京）生物技術有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量測定試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒：南京建成生物工程研究所；復方托吡卡胺滴眼液：參天制藥（中國）有限公司；氧氟沙星眼膏：沈陽興齊眼藥股份有限公司；SYBRGreen 試劑盒：寶生物工程（大連）有限公司；Trizol：天津市大茂化學試劑廠。

JS703C 分析天平：瑞士METTLER TOLEDO 公司；RETI-Port/Scan 21 型ERG 儀器：德國羅蘭公司；micronIV 型OCT 儀器：美國phoenix 公司；LSI20d-Ⅱ型LED 燈：深圳市愛圖仕影像器材有限公司；TES1330A數字照度計：臺灣泰仕電子工業公司；MyCycler 聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀、MyiQ2實時熒光定量PCR 儀：美國Bio-Rad 公司；U-3900Hitachi 紫外分光光度計：日立科學儀器有限公司。

1.2 熟地黃粗提物

稱取熟地黃（符合2015 版《中華人民共和國藥典》標準），加入6 倍體積的蒸餾水提取，提取3 次，合并提取液，提取液經濃縮得到水提物浸膏，再加入95%乙醇進行醇沉，收集沉淀物并進行干燥，制得熟地黃提取物棕色粉末（每克熟地黃提取物含熟地黃3.14 g）。

1.3 實驗動物及分組

健康雄性C57BL/6J 小鼠，6 周齡，體重（18±1）g，許可證號為SCXK（京）2016-0002，飼養于天津科技大學實驗動物中心[（23±2）℃，相對濕度55%，明暗循環為12 h/12 h]。實驗期間小鼠攝食和飲水自由。本研究的所有實驗程序均按照天津科技大學動物實驗倫理委員會批準的方案進行。

實驗前對小鼠眼球進行檢查，排除眼部疾病。經過一周的適應期后，小鼠被隨機分成4 組：正常（CON）組、模型（MOD）組、熟地黃低劑量（SDL）組、熟地黃高劑量（SDH）組，每組各12 只。其中，正常組和模型組給予0.2 mL 無菌生理鹽水灌胃，根據前期預實驗結果，熟地黃低、高劑量組分別給予360、450 mg/kg bw 的劑量灌胃，每日一次，連續8 周。除正常對照組外，各組小鼠均在第9 周放入光照箱中進行光照造模。

1.4 光損傷模型制備

采用自制光照箱造模，每只小鼠被單獨放置在由亞克力透明板制成的10 cm×10 cm×8 cm 小方格中，將光照器懸掛于小鼠頂部50 cm 處，垂直照射，并在與小鼠同一高度處懸掛一溫度計，實時監測溫度，確保溫度維持在（23±2）℃范圍內，排除溫度升高引起小鼠眼球光熱損傷的可能。為避免長時間光照而引起眼球表面脫水，光照前30 min 對小鼠眼球進行涂抹眼藥處理。根據前期預實驗結果，利用照度計將光照強度調整為（9 000±500）Lux，持續照射4 h，連續照射7 d，光照期間正常進食與飲水。光照造模結束后，進行視網膜電圖和光學相干斷層成像等視網膜生理指標檢測。

1.5 視網膜電圖檢測

小鼠暗適應12 h 后，用5%的水合氯醛溶液進行腹腔注射麻醉，注射劑量為0.01 mL/g bw，待小鼠四肢無反應并脊背無弓起現象后用0.1 mg/mL 硫酸阿托品滴眼液擴張瞳孔。小鼠固定在平臺上，以與角膜表面接觸的鍍金絲環電極為活性電極，將電極插入眼睛附近的皮膚和尾部作為參考和接地導線，記錄3.0 b 波振幅。整個實驗過程在紅光下進行。實驗結束后，立即對小鼠眼球表面涂抹氧氟沙星眼膏，防止眼球長時間干燥而引起小鼠眼球脫水。

1.6 光學相干斷層成像

小鼠腹腔注射5%水合氯醛溶液麻醉。待小鼠四肢無反應且脊背無弓形后，將其放置在固定架上并滴加散瞳藥，然后將小鼠右眼球與鏡面緊貼，正確定位眼球位置后進行觀察，獲得OCT 偽彩圖。比較各實驗組小鼠右眼相應的視網膜外核層（outer nuclear layer，ONL）厚度。實驗結束后迅速涂抹眼膏，防止眼球長時間暴露于空氣中引起眼球脫水。

1.7 視網膜組織氧化指標檢測

參照陳春艷等的研究方法[17]，取各組小鼠眼球，在冰盤上分離視網膜組織并置于-80 ℃保存，供待檢測指標SOD、GSH-Px、CAT 和MDA 使用。稱取視網膜組織，按料液比1∶9（g/mL）加入0.9%無菌生理鹽水，在冰水浴下用研磨器研磨成組織勻漿。4 ℃、2 500 r/min 離心15 min，取上清液備用。測定其余各步驟均按照試劑盒說明書進行。

1.8 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative realtime polymerase chain reaction，qPCR）檢測視網膜中與炎癥相關基因表達水平

使用Trizol 提取視網膜組織中的總RNA，反轉錄得cDNA，并于-80 ℃保存。SYBRGreen 試劑盒檢測基因表達水平，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參基因，引物設計如表1 所示。反轉錄及實時熒光定量PCR 程序參照試劑盒具體說明。

1.9 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學處理，結果均以平均值±標準偏差（x±s）表示，采用單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA）評估各組間差異，P＜0.05 具有統計學差異。

2 結果分析

2.1 熟地黃粗提物對小鼠視網膜ERG 結果分析

應用ERG 分析探討熟地黃粗提物對光誘導的小鼠視網膜功能的影響。ERG 的振幅越高，說明小鼠眼球對光的反應敏感性越強。視網膜電生理3.0 b 波振幅見圖1。

圖1 視網膜電生理3.0 b 波振幅Fig.1 Retinal electrophysiology 3.0 b amplitude

如圖1 所示，與正常組相比，光損傷模型組小鼠的3.0 b 波振幅顯著降低（P＜0.01），用熟地黃粗提物干預后，能顯著抑制光誘導的b 波振幅的降低；與模型組相比，熟地黃低、高劑量組振幅分別升高了56.95%和73.18%，具有統計學差異（P＜0.01）。

表1 視網膜組織中相關基因引物序列Table 1 Related gene primer sequences in retinal tissue

2.2 熟地黃粗提物對小鼠視網膜OCT 結果分析

光學相干斷層掃描用于通過利用眼睛中不同組織的不同反射率來分析不同組織的結構和厚度。視網膜ONL 層厚度比較見表2。

表2 視網膜ONL 層厚度比較Table 2 Comparison of retinal ONL thickness

從表2 可以看出，與正常組相比，模型小鼠視網膜的厚度明顯低于正常組（P＜0.01）。與模型組小鼠比較，熟地黃干預的小鼠視網膜ONL 層厚度高于模型小鼠，均具有統計學差異（P＜0.05）。

2.3 熟地黃粗提物對小鼠視網膜中抗氧化酶活力的影響

強光損傷導致過量的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產生，并破環內源性抗氧化酶系統，加速氧化應激的發生。熟地黃粗提物對光損傷小鼠視網膜組織SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量的影響見圖2。

圖2 熟地黃粗提物對光損傷小鼠視網膜組織SOD、GSH-Px、CAT 活力及MDA 含量的影響Fig.2 Effects of crude extracts from Rehmannia glutinosa on activity of SOD，GSH-Px，CAT and content of MDA in retinal tissues of light-damaged mice

如圖2 所示，強光應激后，小鼠視網膜組織內SOD、GSH-Px 和CAT 活力均極顯著降低（P＜0.01），MDA 含量明顯升高（P＜0.01）。熟地黃粗提物干預可以明顯提高視網膜組織中SOD、GSH-Px 和CAT 的活力，顯著降低MDA 水平。

2.4 熟地黃粗提物對小鼠視網膜中促炎基因表達水平的影響

促炎細胞因子的表達與視網膜光氧化損傷有關[5]，因此，試驗研究了MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達水平。熟地黃粗提物對小鼠視網膜中MCP-1、TNFα 和IL-1β mRNA 表達的影響見圖3。

圖3 熟地黃粗提物對小鼠視網膜中基因MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達的影響Fig.3 Effects of crude extract of Rehmannia glutinosa on mRNA expression of genes MCP-1，TNF-α and IL-1β mRNA in retina of mice

由圖3 可知，模型組MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 相對表達量均顯著高于正常組；與模型組相比，低、高劑量熟地黃提取物在不同水平上抑制了TNFα、MCP-1 和IL-1β 的表達（P＜0.05），且熟地黃粗提物高劑量組的抑制作用優于低劑量組。

3 結論與討論

熟地黃已經有數千年的食用歷史。劉培建等研究表明，熟地黃具有抗衰老和抗氧化等多種藥理特性[18]。REN 等研究表明，熟地黃水提物可通過激活Nrf2 信號通路逆轉百草枯誘導的小鼠糖代謝紊亂[19]。大量研究表明，熟地黃與枸杞、菟絲子等中藥復配具有緩解視疲勞[20]和保護視網膜[21]的功效。此外，熟地黃水提物可抑制小鼠星形膠質細胞中TNF-α 和IL-1β 的產生[16]。熟地黃具有良好的抗氧化和抗炎能力。視功能受損與感光細胞丟失有關，在光誘導視網膜損傷模型中，強光照射降低了ERG 3.0 b 波振幅，以及ONL 層的厚度，這與以前的報道一致[22]。

內源性抗氧化酶系統可在光損傷后被激活。過量的ROS 產生破環了這種防御機制，并加速氧化應激的發生。SOD、GSH-Px 和CAT 是抗氧化防御系統的重要酶系，它們能清除體內的活性氧自由基[23]。實驗結果顯示，熟地黃粗提物可以提高視網膜組織中SOD、GSHPx 和CAT 的活力，并且熟地黃低、高劑量組中MDA含量均顯著低于模型組。由此可以說明，熟地黃粗提物能夠提高機體的抗氧化能力。

內源性抗氧化酶的減少導致視網膜的光氧化應激，從而增加促炎癥細胞因子的水平[24]。ROS 是促炎性細胞因子（如MCP-1、TNF-α 和IL-1β）釋放的強烈刺激物，它們損傷視網膜細胞，在視網膜變性的發病機制中發揮重要作用[24]。通過對視網膜組織中與促炎相關基因表達水平的分析，可以看出光損傷導致MCP-1、TNF-α 和IL-1β mRNA 表達水平顯著升高，給予熟地黃粗提物干預后可逆轉這種情況。

綜上所述，熟地黃粗提物可以提高視網膜組織的抗氧化能力并調控促炎相關基因的表達，從而對氧化應激引起的視網膜損傷和視疲勞具有緩解作用。為進一步探究熟地黃對視網膜的保護作用，可在后面的研究對熟地黃成分進行進一步分離，以期為視力保護和緩解視疲勞產品的開發提供科學依據。