美藤果殼多酚物質的提純及其抗氧化性

林錦銘，蔡尤林，李俊健，鐘淳菲，杜冰，2*，黎攀，2*

（1.華南農業大學食品學院，廣東廣州510642；2.云南省杜冰專家工作站，云南普洱665008）

美藤果（Plukenetia volubilis Linneo）又稱為印加果、南美油藤、印奇果、星油藤等，為大戟科藤本植物、多年生油料作物。美藤果原產于南美洲秘魯亞馬遜河流域雨林，2006 年，由中國科學院西雙版納熱帶植物園從秘魯引種成功。2011 年7 月，由普洱聯眾生物資源開發有限公司申請，中國科學院昆明植物研究所標本館組織專家鑒定，確認將其正式定名為“美藤果”[1]。2013年1 月4 日，衛生部2013 年第1 號公告批準美藤果油作為新資源食品[2]，開啟了開發美藤果新一輪熱潮。美藤果種子富含油脂（35%～60%）和蛋白質（27%）及帶有熱不穩定苦味成分[3]，其中不飽和脂肪酸含量達92%以上，對人體具有良好營養作用，具有預防心血管疾病、保養肌膚等作用[4]。

目前，國內外對美藤果油的研究較多[5-6]，而美藤果殼作為美藤果提煉油后的廢棄物，對其利用卻少有報道。美藤果殼中多酚含量豐富，是良好的多酚來源，而植物多酚在食品、醫藥中應用廣泛[7]。在食品中，植物多酚可作為一種天然的抗氧化添加劑，相對于人工合成的抗氧化添加劑更安全[8]。近代醫學研究顯示，氧化損傷是導致許多慢性病，如心血管病、癌癥和衰老性疾病的重要原因，如何阻止氧化損傷、清除體內自由基是醫學上預防和治療這些慢性病的突破口，而多酚的抗氧化功能可以對這些慢性病起到預防作用[9-14]。本文開展了美藤果殼多酚的提取純化工藝條件研究，并與商品化的抗氧化添加劑丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）、特丁基對苯二酚（tert-butylhydroquinone，TBHQ）、維生素C 的體外抗氧化性進行對比，確定美藤果殼多酚的主要成分，為美藤果殼多酚的深入開發及其作為抗氧化劑在食品加工業、臨床醫藥中的應用提供一些科學數據支持，美藤果殼綜合開發利用具有較好的發展前景。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

美藤果殼：普洱聯眾生物資源開發有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、三羥甲基氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris]：美國Sigma 公司；無水乙醇、碳酸鈉、沒食子酸標準品、福林酚試劑、2，6-二叔丁基對甲酚（BHT）、叔丁基對苯二酚（TBHQ）、維生素C、雙氧水、三氯化鐵等（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠。

HH-6 數顯恒溫水浴鍋：常州奧華儀器有限公司；80 目國家標準檢驗篩：浙江上虞市道墟五四儀器紗篩廠；PL203 電子精密天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SHZ-III 型循環水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；UV-5100 紫外分光光度計：上海元析儀器有限公司；LC1260 反相高效液色譜儀：Agilent 公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的預處理

將美藤果殼用多功能粉碎機粉碎處理，過80 目篩得美藤果殼干粉，按GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》，測得其含水量為2.95%。剩余粉末裝入密封袋中并置于-18 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 乙醇回流法提取美藤果殼多酚

準確稱取1.000 g 美藤果殼干粉，按適當的料液比、合適比例的乙醇溶液為提取劑，于普通加熱回流裝置，80 ℃回流提取1 h，然后用布氏漏斗抽濾，上清液減壓濃縮過濾后，用蒸餾水定容至250 mL。其中美藤果殼多酚得率計算公式如下：

多酚得率/%=（提取液濃度×體積）/樣品質量×100

1.2.3 美藤果殼總多酚含量的測定

采用福林酚法[15-16]測定美藤果殼總多酚含量，以沒食子酸標準溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.4 最佳提取工藝條件優化

以美藤果殼多酚得率作為考察指標，分別固定A乙醇濃度、B 料液比、C 提取溫度和D 提取時間進行單因素試驗。試驗重復3 次，試驗結果取平均值。然后根據單因素試驗結果各取3 個水平。按L9（34）正交設計表進行正交試驗，因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.5 大孔吸附樹脂法純化美藤果殼多酚

1.2.5.1 樣品濃度影響

稱取20.0 g AB-8 樹脂，分別加入濃度0.5 mg/mL～3.0 mg/mL 樣品液。25 ℃條件下振蕩吸附一定時間，取樣品液測多酚含量。

1.2.5.2 洗脫劑濃度對解吸的影響

吸附后分別加入10%、30%、50%、70%、90%乙醇50 mL，置于恒溫恒速振蕩器中，在25 ℃條件下振蕩解吸一定時間，取等量解吸液測定多酚含量。

1.2.5.3 上樣液流速的選擇

大孔樹脂濕法裝柱，分別以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV/h 的流速進行樣品上柱，測定漏出液中多酚含量，研究上樣液流速對動態吸附的影響。

1.2.5.4 洗脫流速對洗脫的影響

吸附后用3 倍柱體積蒸餾水沖洗樹脂柱。相同體積洗脫液分別按照1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 BV/h 的流速進行洗脫，測定其中多酚的含量，計算解吸率。

1.2.5.5 洗脫體積的影響

洗脫樹脂上吸附的美藤果殼多酚，分部收集洗脫液并測定各管洗脫液中的美藤果殼多酚含量，以洗脫液體積為橫坐標，洗脫液中多酚濃度為縱坐標，繪制洗脫曲線。

1.2.6 美藤果殼提取物成分分析

采用安捷倫1260 型高效液相色譜（high-performance liquid chromatography -diode array detection，HPLC-DAD）測定多酚成分。儀器條件為Zorbox SBC18 色譜柱；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：20 μL；檢測器：二極管陣列檢測器（diode array detection，DAD），280 nm 處進行檢測。流動相組成：0.4%冰乙酸超純水（A）和乙腈（B）；以標準品在色譜柱上的保留時間為對照，判斷各多酚成分。

1.2.7 美藤果殼提取物抗氧化特性

將提取液真空冷凍干燥后，制得美藤果殼提取物粉末，通過福林酚法測定提取物粉末中總多酚含量為26%。以該美藤果殼提取物粉末作為受試物并配制成一系列濃度，通過其對羥自由基、DPPH 自由基的清除作用研究美藤果殼提取物的抗氧化性。

1.2.7.1 清除羥自由基作用

通過Fenton 體系（甲基紫—Fe2+—H2O2）產生羥自由基，采用分光光度法測定上述提取物對羥自由基的清除作用[17]。在10 mL 具塞比色皿中依次加入1.0 mL（2.0×10-4mol/L）甲基紫溶液、1.0 mL（1.0×10-3mol/L）Fe2+溶液、1.0 mL（0.12%）H2O2溶液，并用Tris-HCl 緩沖液（pH 8.25）調節pH 4.5 后用水稀釋到10 mL，搖勻放置30 min 后以水為空白參比在578 nm 處測定吸光值A0；測定樣品時在上述體系中預加入1.0 mL 樣品溶液，同上測定吸光值AS，同體積樣品溶液、Tris-HCl 及水溶液作空白參比；甲基紫及Tris-HCl 緩沖液測定吸光值A，以水為空白參比。則清除率為：S/%＝[（AS－A0）/（A－A0）]×100。

回歸擬合樣品濃度與清除率的量效關系曲線，算出提取物的的半數抑制濃度（IC50）值并與其他抗氧化劑進行對比。

1.2.7.2 DPPH 自由基清除作用

在3.0 mL 6 μmol/L DPPH-無水乙醇溶液中加入500 μL 樣品溶液，搖勻放置30 min，測定其在517 nm下的吸光值（AS）；以500 μL 無水乙醇代替樣品為空白對照（A0）；以500 μL 樣品與3.0 mL 無水乙醇混合液為樣品對照（AX）以消除樣品本身顏色的影響，測定DPPH 自由基清除率[18]。清除率計算公式：S/%＝（A0－A）/A0×100。

回歸擬合樣品濃度與清除率的量效關系曲線，計算出提取物的半數抑制濃度（IC50）數值并與其他抗氧化劑進行對比。

1.3 數據處理

試驗數據采用Microsoft Excel 2016 進行處理，采用SPSS 19.0 進行統計學分析。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

試驗得沒食子酸標準曲線如圖1 所示，回歸方程為Y=100.4X+0.020 8，R2=0.997 2，線性較好。其中Y 為吸光值，X 為沒食子酸濃度，mg/mL。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇濃度對美藤果殼多酚得率的影響

乙醇濃度對多酚得率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對多酚得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on polyphenol yield

由圖2 可知，美藤果殼多酚得率隨乙醇濃度提高而提高。乙醇濃度小于70%時，隨乙醇濃度提高，多酚得率的提高速度較快，乙醇濃度大于70%后，多酚得率提高速度較緩慢。可能是因為隨著乙醇濃度的增大，其他脂溶性物質和多酚競爭溶解致使多酚得率上升緩慢[19]。綜合考慮選擇70%乙醇提取多酚為宜。

2.2.2 料液比對美藤果殼多酚得率的影響

料液比對多酚得率的影響見圖3。

圖3 料液比對多酚得率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on polyphenol yield

由圖3 可知，料液比為1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50（g/mL）時，多酚得率相對較低，料液比為1 ∶60（g/mL）時，多酚得率有明顯上升，料液比達1 ∶70（g/mL）時，多酚得率又隨之下降。當溶劑比例較低時，溶劑不能將多酚完全提取，增加溶劑用量，未溶解的多酚向提取劑中轉移，溶劑與原料的比值越大，濃度梯度越大，有效成分的擴散速率也越大[20]。當料液比1 ∶60（g/mL）時，多酚得率最高，再繼續增大溶劑比例不利于多酚提取，所以應選擇料液比為1 ∶60（g/mL）。

2.2.3 提取溫度對美藤果殼多酚得率的影響

提取溫度對多酚得率的影響見圖4。

圖4 提取溫度對多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on polyphenol yield

由圖4 看出，溫度對美藤果殼多酚得率的影響比較明顯。溫度較低時，美藤果殼多酚得率較低，在一定范圍內，隨著溫度的升高，多酚得率也隨之升高。一方面可能是由于多酚在熱水中的溶解度較大；另一方面可能溫度的升高加速了分子的運動，氫鍵更容易斷裂，多酚的滲透、溶解、擴散速度也加快，因而酚類物質更易于從原料中溶出，提高乙醇提取多酚的速度。但溫度過高時一些熱敏性多酚成分會發生氧化分解，故提取溫度定在90 ℃為宜。

2.2.4 提取時間對美藤果殼多酚得率的影響

提取時間對多酚得率的影響見圖5。

圖5 提取時間對多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on polyphenol yield

由圖5 看出，在一定范圍內，隨著提取時間的增加，美藤果殼多酚得率也隨之增大，當提取時間大于2.0 h 后，多酚得率的增大趨于平緩。可見提取時間越長，美藤果殼多酚的提取量越高，這是因為隨著回流時間的加長可以使得多酚更加充分地溶解于溶劑中[21]。當提取時間≥2.0 h，多酚得率增加趨勢趨于平緩，提取時間的進一步延長對多酚得率沒有顯著影響，考慮到實際生產的提取效率，故提取時間定為2.0 h 為宜。

2.3 正交試驗結果

根據單因素試驗結果，按正交設計表L9（34）安排試驗，用福林酚法測定多酚得率，結果如表2。

表2 正交試驗結果及極差分析Table 2 Orthogonal experiment results and range analysis

表2 極差分析結果表明，各因素對多酚得率影響大小次序為C>A>B>D，即提取溫度＞乙醇濃度＞料液比＞提取時間，最優條件組合為C3A2B2D3，即提取溫度90 ℃，乙醇濃度70%，料液比為1 ∶55（g/mL），提取時間2.0 h 為最優方案。對方案進行驗證試驗。準確稱1.000 g 美藤果殼粉，按最佳工藝條件C3A2B2D3，進行3次平行試驗，分別測定多酚得率，計算得多酚的平均得率為4.79%，高于正交試驗中各試驗的得率，說明最佳工藝合理。

2.4 大孔吸附樹脂法純化美藤果殼多酚試驗結果

樣品濃度對大孔樹脂吸附效果的影響見圖6，解吸劑濃度對美藤果殼多酚解吸的影響見圖7，上柱液流速對大孔樹脂吸附的影響見圖8，洗脫流速對洗脫效果的影響見圖9，AB-8 大孔樹脂洗脫曲線見圖10。

圖6 樣品濃度對大孔樹脂吸附效果的影響Fig.6 Effect of sample concentration on adsorption of macroporous resin

圖7 解吸劑濃度對美藤果殼多酚解吸的影響Fig.7 Effect of concentration of desorption agent on the desorption of polyphenols from sacha inchi shell

圖8 上柱液流速對大孔樹脂吸附的影響Fig.8 Effect of flow rate on adsorption of macroporous resin

圖9 洗脫流速對洗脫效果的影響Fig.9 Effect of elution velocity on elution efficiency

圖10 AB-8 大孔樹脂洗脫曲線Fig.10 AB-8 macroporous resin

圖6 表明，吸附率隨樣品濃度增加呈先升高后降低趨勢，當樣品濃度在1.5 mg/mL 時吸附率最大；圖7表明，隨著乙醇濃度的升高解吸率逐漸增加，乙醇濃度超過30%時，繼續增加乙醇濃度，對洗脫效果的提升作用不大；圖8 顯示過高的上樣流速不利于多酚的吸附，上柱流速為2.0 BV/h 左右多酚吸附率最高，因此選擇上柱流速為2.0 BV/h；圖9 顯示洗脫流速1.5 BV/h左右洗脫效果較好，因此洗脫流速定為1.5 BV/h；圖10顯示當洗脫體積達到1.6 BV 左右時，洗脫液中的多酚含量達到最大值，洗脫效果最好，因此洗脫液體積為1.6 BV 比較適宜。

綜上所述，AB-8 大孔樹脂對美藤果殼多酚分離純化的最佳工藝：以乙醇粗提物為原料，乙醇作為洗脫劑，上樣速度為2.0 BV/h，采用30%乙醇溶液以1.5 BV/h 的洗脫速度洗脫4.0 BV，最終純化液多酚純度可達到68.3%

2.5 美藤果殼多酚純化前后成分分析

大孔樹脂AB-8 純化前美藤果殼多酚提取物高效液相色譜（highperformanceliquidchromatography，HPLC）見圖11，大孔樹脂AB-8 純化后美藤果殼多酚提取物HPLC 見圖12。

如圖11、圖12 所示，對比發現美藤果殼多酚提取物經過大孔樹脂AB-8 純化后不會造成峰的丟失，即單體酚組成未減少，并且峰面積的下降程度較低，即單體酚經純化后損失量較少（約5%左右）。美藤果殼多酚提取物純化前保留時間3 min～4 min 之間有許多雜峰，可見這類雜質水溶性較好，可能是粗提后通過旋轉蒸發無法除去的殘留乙醇；而經大孔樹脂AB-8 純化后雜峰去除效果較好，且純化前保留時間大于4 min的峰均被很好地保留，由此可見利用大孔樹脂AB-8純化美藤果殼多酚提取物是可行的。

結合標準品的HPLC 分析圖譜及混合標準品的HPLC 分析圖譜對純化后多酚提取物HPLC 譜分析結果見表3。

圖11 大孔樹脂AB-8 純化前美藤果殼多酚提取物HPLCFig.11 HPLC of polyphenol extract from the shell of sacha inchi before purification with macroporous resin AB-8

圖12 大孔樹脂AB-8 純化后美藤果殼多酚提取物HPLCFig.12 HPLC of polyphenol extract from the shell of sacha inchi after purification with macroporous resin AB-8

表3 純化后美藤果殼多酚提取物HPLC 分析結果Table 3 HPLC analysis results of polyphenol extract from the shell of sacha inchi after purification

由表3 可知，美藤果殼多酚經純化主要成分為沒食子酸、蘆丁、兒茶素、單寧和異槲皮苷，含量分別為9.28、7.29、5.54、4.31、2.93 μg/mL。

2.6 抗氧化性測定結果

2.6.1 美藤果殼多酚對羥自由基的清除作用

BHT、TBHQ、維生素C、美藤果殼多酚等物質的濃度與羥自由基清除率的量效關系曲線如圖13 所示。

圖13 各樣品質量濃度與羥自由基清除率量效關系Fig.13 Relationship between the mass concentration of each sample and the scavenging rate of hydroxyl radical

利用擬合曲線計算出美藤果殼多酚的IC50值，即清除率為50%時樣品的濃度為IC50＝0.586 mg/mL。

羥自由基是活性氧的一種，在體內的形成主要是由過氧化物負離子和過氧化氫反應生成，羥自由基能殺死紅細胞，降解DNA、細胞膜和多糖化合物，對人體的健康產生巨大的危害[22-24]。研究美藤果殼多酚對羥自由基的清除效果既能評定其抗氧化能力，還能夠評定其對人體健康的保護作用。

由圖13 可知羥自由基的清除率隨樣品的質量濃度的升高而升高，并且在同等濃度下美藤果殼多酚的羥自由基清除率>TBHQ 的羥自由基清除率>VC的羥自由基清除率>BHT 的羥自由基清除率。在較低濃度下，美藤果殼多酚相對于TBHQ、VC、BHT，其對羥自由基清除效果的優勢就比較明顯，隨著濃度的升高，清除率也不斷升高。當質量濃度均為700 mg/L 時，其清除羥自由基的作用分別是TBHQ、VC、BHT 的3.19 倍、6.61 倍和41.30 倍，可見美藤果殼多酚對羥自由基的清除作用均要優于TBHQ、VC、BHT。

2.6.2 美藤果多酚對DPPH 自由基的清除作用

BHT、TBHQ、維生素C、美藤果殼多酚提取物的濃度與DPPH 自由基清除率的量效關系曲線如圖14所示。

利用擬合曲線計算出提取物的IC50值，即清除率為50%時樣品的濃度為IC50＝7.51×10-3mg/mL。

圖14 各樣品質量濃度與DPPH 清除率量效關系Fig.14 relationship between mass concentration of each sample and DPPH clearance

由圖14 可知，美藤果殼多酚的DPPH 自由基清除率>TBHQ 的DPPH 自由基清除率>VC的DPPH 自由基清除率>BHT 的DPPH 自由基清除率，美藤果殼多酚在較低濃度下就顯示出其對DPPH 自由基良好的清除率，且清除效率隨著質量濃度的升高而提升。當質量濃度均為20 mg/L 時，其清除DPPH 自由基的作用分別是TBHQ、VC、BHT 的1.24 倍、1.76 倍和7.02 倍，可見美藤果殼多酚對DPPH 自由基的清除作用均要優于TBHQ、VC、BHT。

3 結論

影響美藤果殼多酚得率的4 個因素中，影響程度為：提取溫度>乙醇濃度>料液比>提取時間。最佳工藝為提取溫度90 ℃，乙醇濃度為70%，料液比為1∶55（g/mL），反應時間為2.0 h 的條件下提取美藤果殼多酚。經驗證試驗多酚得率為4.79%。AB-8 大孔樹脂對美藤果殼多酚分離純化的最佳工藝為以乙醇為洗脫劑，上樣速度為2.0 BV/h，采用30%乙醇溶液以1.5 BV/h 的洗脫速度洗脫4.0 BV。

美藤果殼多酚主要為：沒食子酸、蘆丁、兒茶素、單寧和異槲皮苷，濃度分別為9.28、7.29、5.54、4.31、2.93 μg/mL。美藤果殼多酚對羥自由基、DPPH 自由基的半數清除濃度IC50分別0.586、7.51×10-3mg/mL，且清除效果均顯著優于TBHQ、VC、BHT。因此美藤果殼多酚是一種優質有效的抗氧化劑。