均勻設計法優化灰樹花多糖超聲波輔助提取工藝及其抗氧化活性分析

曹丹，孫于寒，彭浩，2*蘭阿峰，2

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中723000）

灰樹花（Grifola frondosa）別名貝葉多孔菌，俗稱“舞菇”，是一種十分有價值的食藥用真菌，其子實體和菌絲體中均含具有多種藥理作用及生物活性的物質——灰樹花多糖[1-3]。灰樹花多糖是灰樹花主要活性成分之一，是一種由葡聚糖、葡萄糖、木糖、巖藻糖、甘露糖及少量蛋白質組成的雜多糖。其結構多為β-1，3-葡聚糖，少量為α-1，4-葡聚糖、α-1，6-葡聚糖[4-5]。其中β-1，3-葡聚糖能極大地提高人體免疫力，且具有強大的自由基清除能力[6]。隨著生活水平的日益提高，人們越來越注重健康，也更加提倡天然健康食品。因此，具有調節身體機能、預防疾病的灰樹花多糖逐漸受到關注[7]。

灰樹花多糖以其獨特的食藥用價值迅速成為研究的熱點，而高效的提取方法成為其研究的關鍵。目前多糖的提取方法主要有超聲提取法、生物酶提取法、微波提取法等[8-9]。與現有方法相比較，超聲提取法具有操作簡單、提取率高，對設備要求較低，提取耗時短等特點，在真菌多糖的工業生產中有較大應用潛力[10-12]。近年來，有關灰樹花多糖提取優化的研究主要以響應曲面法和正交試驗法為主，未見采用均勻設計法進行提取條件優化。均勻設計法可自動將各試驗因素進行分類和排序，能減少試驗次數，提高優化進程。程凱凱等[13]采用均勻設計法對泰山赤靈芝多糖的提取工藝進行優化，結果表明優化后的提取條件穩定性更好，多糖提取率更高。為了更加高效地提取灰樹花β-葡聚糖，本試驗采用均勻設計法對灰樹花多糖超聲波輔助提取工藝進行優化，旨在獲得高提取率的優化設計方案，加快灰樹花多糖在醫療保健、醫藥、農業、食品等方面的開發利用[14]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰樹花菌種（HZ-01）：陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供；葡萄糖（分析純）、蛋白胨（分析純）、KH2PO4（分析純）、MgSO4（分析純）：天津市盛奧化學試劑有限公司；瓊脂（生物試劑）：北京奧博星生物技術有限責任公司；VB1：華中藥業有限公司；土豆：市售。

RE-6000A 型旋轉蒸發儀：上海亞榮儀器設備有限公司；SW-CJ-1D 型單人超凈工作臺：上海蘇凈實業有限公司；YXQ-LS-50S 型高壓滅菌鍋：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；KQ5200DE 型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；UV2550 型紫外分光光度計：日本島津公司；XO-SM100 超聲波微波協同反應工作站：南京先歐儀器制造有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的配制

基礎培養基：葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，VB110.0 mg/L，瓊脂19.0 g/L，pH 自然。

發酵培養基：土豆200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，KH2PO41.0 g/L，MgSO40.5 g/L，VB110.0 mg/L，瓊脂19.0 g/L，pH 自然。

1.2.2 菌種活化

在無菌操作臺中，用手術刀取0.5 cm2保藏菌種于25 ℃恒溫培養，待菌絲長滿平板后取出，置于4 ℃冰箱內保存備用。

1.2.3 灰樹花多糖的超聲提取工藝

將灰樹花菌絲體置于烘箱中，60 ℃烘干至恒重，24 000 r/min 粉碎1 min，過40 目篩，稱取灰樹花菌絲體粉末10.0 g，按照水料比5∶1（mL/g），加入超純水，調節pH 值，在一定的超聲功率下提取一定時間，抽濾，按照此法提取若干次，合并濾液真空濃縮，加入3 倍體積的無水乙醇，冷藏過夜，收集沉淀物，去除乙醇得到灰樹花粗多糖[15]。

1.2.4 單因素試驗

在1.2.3 工藝條件下，分別比較不同浸提次數（1、2、3、4、5 次）、不同提取時間（15、35、55、75、95、115 min）、不同提取溫度（26、45、60、75、90、105 ℃）對灰樹花多糖和β-葡聚糖提取率的影響。

1.2.5 均勻設計試驗

根據均勻設計試驗原理，在預試驗的基礎上，結合單因素試驗結果，選取超聲波功率（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）和水料比（X4）為考察對象，以灰樹花多糖提取率（Y1）和β-葡聚糖提取率（Y2）為考察指標，采用四因素七水平均勻試驗分析法確定其最佳提取工藝條件，并對所獲得試驗結果進行驗證。試驗因素水平編碼見表1。

表1 試驗因素及水平Table 1 Factors and levels

1.2.6 灰樹花多糖含量及提取率測定

多糖含量采用苯酚-硫酸法[17]測定，以葡萄糖為標準品制作標準曲線[16]，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y1=0.062 9x-0.045 7，R2=0.997，由回歸方程計算得出多糖含量。

多糖提取率/%=多糖含量/灰樹花菌絲體粉末質量×100。

1.2.7 灰樹花菌絲體β-葡聚糖含量及提取率測定

β-葡聚糖含量采用剛果紅法[19]測定，以β-葡聚糖為標準品制作標準曲線[18]，β-葡聚糖含量為橫坐標，β-葡聚糖溶液吸光值為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y2=0.282 8x-0.252 1，R2=0.998。由回歸方程計算得出β-葡聚糖含量。

β-葡聚糖提取率/（mg/g）=β-葡聚糖含量/灰樹花菌絲體粉末質量。

1.2.8 體外抗氧化活性的測定

取濃縮后的提取液分別進行還原能力、DPPH 自由基清除能力及羥自由基清除能力測定。

1.2.8.1 還原能力測定

參考鐵氰化鉀還原法[20]，將待測樣品用雙蒸水分別配制成不同濃度梯度，取1 mL 依次加入2.5 mL pH 6.6 磷酸緩沖液、2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后于50 ℃水浴鍋中反應20 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸溶液，于離心機中4 ℃，3 000 r/min 離心10 min。取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL 超純水、2.5 mL 0.1%的三氯乙酸溶液，以蒸餾水代替上述操作中的鐵氰化鉀溶液為空白組，靜置10 min 測定樣品在700 nm 處的吸光度值。以抗壞血酸VC作為陽性對照，重復3 次取平均值。

1.2.8.2 DPPH 自由基清除能力的測定

參考DPPH 清除法[21]，將待測樣品用雙蒸水分別配制成不同濃度梯度，取2 mL 加入2 mL 0.1 mmol/L、95%乙醇配制的DPPH 溶液，混合均勻，暗反應30 min后5 000 r/min 離心5 min，取上清液在519 nm 處測定吸光值，以雙蒸水代替上述操作中的樣品溶液為空白組。以抗壞血酸VC做陽性對照，重復3 次取平均值。并按下列公式計算DPPH 自由基清除率。

式中：AX為2 mL DPPH 溶液+2 mL 雙蒸水吸光值；AX0為2 mL DPPH 溶液+2 mL 樣品溶液吸光值；A0為2 mL 95%乙醇溶液+2 mL 樣品溶液吸光值。

1.2.8.3 羥自由基清除能力的測定

參考羥自由基清除法[22]，將待測樣品用雙蒸水分別配制成不同濃度梯度，取0.5 mL 樣品溶液分別加入0.5 mL 6 mmol/L 硫酸亞鐵溶液、0.5 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液和0.5 mL 8.8 mmol/L 過氧化氫溶液，混合均勻，于37 ℃反應15 min，在波長510 nm 處測定吸光值，以雙蒸水作為空白，同時以蒸餾水替代H2O2作為損傷組，抗壞血酸VC作陽性對照，重復3 次取平均值。

式中：AX為0.5 mL 樣品溶液+0.5 mL 硫酸亞鐵溶液+0.5 mL 水楊酸－乙醇溶液+0.5 mL 過氧化氫溶液的吸光值；AX0為0.5 mL 樣品溶液+0.5 mL 硫酸亞鐵溶液+0.5 mL 水楊酸－乙醇溶液+0.5 mL 雙蒸水的吸光值；A0為0.5 mL 雙蒸水+0.5 mL 硫酸亞鐵溶液+0.5 mL水楊酸－乙醇溶液+0.5 mL 過氧化氫溶液的吸光值。

1.3 數據處理

采用Excel2013、SPSS22.0 軟件和GraphPadPrism 7軟件進行數據統計、處理分析和作圖，結果取3 次試驗的平均值。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

不同浸提次數對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 不同浸提次數對多糖提取率的影響Fig.1 Effect of different extraction times on polysaccharide extraction rate

由圖1 可知，隨著浸提次數的增加，多糖和β-葡聚糖提取率增加。浸提2 次時的提取率與3、4、5 次時相差不大，且與第1 次相比提取率有所提升，但提取次數的增加也會帶來原料成本的增加，因此綜合考慮選擇浸提2 次。

不同提取時間對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 不同提取時間對多糖提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction time on polysaccharide extraction rate

圖2 表明，提取時間對灰樹花多糖和β-葡聚糖提取率的影響呈先增加后降低的趨勢。多糖提取率和β-葡聚糖提取率均隨著時間的增加而增長，在提取時間達到70 min 時，多糖提取率和β-葡聚糖提取率均達到最高，分別為19.243%和2.531 mg/g，而長時間的超聲波易使多糖的降解大于多糖的浸出，導致多糖含量降低。因此均勻設計試驗選取60 min～90 min 進一步優化工藝參數。

不同提取溫度對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 表明，隨著提取溫度的升高，多糖含量逐漸上升，但過高的溫度易導致大分子多糖斷裂，影響多糖提取的增加量，因此多糖提取率降低。結果顯示，當待測樣品在室溫（26 ℃）條件下時，提取率最低；當提取溫度達到60 ℃時，多糖和β-葡聚糖提取率最高，分別為20.287%和2.816 mg/g，其中多糖提取率是室溫時的1.8 倍，β-葡聚糖提取率為室溫時的3.2 倍。因此均勻設計試驗選取40 ℃～70 ℃進一步優化工藝參數。

圖3 不同提取溫度對多糖提取率的影響Fig.3 Effect of different extraction temperatures on polysaccharide extraction rate

2.2 均勻設計試驗結果與分析

2.2.1 試驗結果

均勻設計試驗方案結果處理與分析見表2。

表2 均勻設計試驗結果Table 2 Uniform experimental design and results

根據表2 各參數的多糖提取率和β-葡聚糖提取率試驗結果，分別經SPSS 22.0 統計軟件進行均勻設計二次回歸多項式逐步回歸分析，得到相應回歸模型Y1和Y2：

方差分析見表3、表4。

表3 Y1 方差分析Table 3 Y1 analysis of variance

表4 Y2 方差分析Table 4 Y2 analysis of variance

2.2.2 工藝驗證

按1.2.3 方法進行驗證試驗，選取上述最佳工藝參數進行提取，考慮實際操作情況，將多糖最佳超聲波輔助提取功率修正為500 W；將β-葡聚糖最佳超聲波輔助提取功率修正為450 W。多糖提取率分別為23.832%、23.023%和22.311%，平均值為23.055%；β-葡聚糖提取率分別為3.092、2.976、3.023 mg/g，平均值為3.030 mg/g；均與預測參數值接近，相對誤差分別為0.58%和1.013%，可知結果優化后試驗結果準確，且重復性好。

2.3 抗氧化活性分析

物質的還原力越高，表明其抗氧化性越好[23]。不同濃度的灰樹花多糖組分的還原能力效果如圖4 所示。

圖4 多糖還原能力Fig.4 Polysaccharide reduction ability

由圖4 可知，樣品的還原能力隨著樣品濃度的增加而逐漸增強，當濃度達到2.5 mg/mL 時，樣品的OD700nm值為0.561±0.005，表明其抗氧化性效果明顯。灰樹花多糖成分還原能力低于陽性對照VC的還原能力。

EC50是指清除率為50%時物質的質量濃度，物質EC50值低于10 mg/mL 時，表明其抗氧化性良好[24]。不同濃度的灰樹花多糖組分對DPPH 自由基的清除效果如圖5 所示。

圖5 DPPH 自由基清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging ability

由圖5 可知，灰樹花多糖對DPPH 自由基清除能力隨樣品濃度的升高而增大。當樣品清除率為50 %時，其質量濃度為0.796 mg/mL，即EC50為0.796mg/mL，因此灰樹花多糖具有較好的DPPH 自由基清除能力，具備較好的抗氧化能力。

羥基的化學性質極為活潑，是對機體危害最大的自由基[25]。不同濃度的灰樹花多糖組分對羥自由基的清除效果如圖6 所示。

圖6 羥自由基清除能力Fig.6 Hydroxyl free radical scavenging ability

由圖6 可知，樣品對羥自由基具備一定的清除能力，且清除率明顯高于陽性對照VC對羥自由基的清除效果。多糖樣品的清除能力隨濃度的增大而增大，呈量效關系。

3 結論

試驗對灰樹花多糖的提取工藝進行優化研究，通過單因素試驗結合均勻設計試驗優化了提取工藝，獲得最佳超聲波輔助提取工藝：浸提2 次，提取時間64 min，超聲波功率500 W，提取溫度43 ℃，水料比31∶1（mL/g），在此條件下，灰樹花多糖的提取率為23.055%；β-葡聚糖的提取工藝為：浸提2 次，提取時間74 min，超聲波功率450 W，提取溫度68 ℃，水料比28∶1（mL/g），在此條件下的提取率為3.030 mg/g；此外，對提取的灰樹花多糖進行了抗氧化活性研究。結果表明，灰樹花多糖具備一定的抗氧化活性，灰樹花多糖的還原力OD700mn值為0.561±0.005，DPPH 自由基清除率為58.27%，羥自由基的清除率為89.58%，其總還原力和DPPH 自由基清除率略低于對照組，但存在線性量效關系。

本試驗采用均勻設計法對灰樹花多糖超聲波提取工藝進行優化，工藝優化結果經驗證，方法穩定可行，提取時間耗時短，對儀器設備的要求低，節約成本的同時也簡化了流程，可為灰樹花多糖的工業化生產提供科學的數據參考。