落地生根凍干粉對人癌細胞增殖和細胞凋亡的影響

王雪純 曹旭梅 陸瑩 陳麗

摘? 要：為初步研究落地生根凍干粉（BPFP）對人癌細胞增殖的影響，應用CCK-8實驗檢測不同質量濃度BPFP對人肝癌HepG2細胞、人腦膠質瘤U87細胞和人前列腺癌DU145細胞增殖的影響;用Hoechst 凋亡試劑盒檢測不同質量濃度BPFP對細胞凋亡的影響.實驗結果顯示：BPFP對HepG2、U87和DU145細胞生長均有一定的抑制作用;BPFP作用48 h對HepG2細胞增殖抑制作用明顯，抑制率在82%以上，其抑制程度與時間呈依賴性，但與劑量不呈依賴性;質量濃度為150 μg/mL以上作用48 h對U87細胞增殖抑制明顯，增殖抑制率大于80%;質量濃度為250 μg/mL作用48 h對DU145增殖抑制作用最強，達到100%.BPFP作用24 h對HepG2、U87和DU145細胞凋亡均有一定的促進作用.實驗結果提示，BPFP對HepG2、U87和DU145細胞的增殖有抑制作用，可能與BPFP能促進細胞凋亡有關.

關鍵詞：落地生根凍干粉;細胞增殖;細胞凋亡;人肝癌HepG2細胞;人腦膠質瘤U87細胞;人前列腺癌DU145細胞

中圖分類號：TQ460.7;R285.5? ? ? ? DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2021.01.002

0? ? 引言

腫瘤的治療到目前為止還沒有十分令人滿意的方法，采用手術、化療和放療等方法盡管有一定療效，但常常對機體產生嚴重的毒副作用.近年來，中醫藥在癌癥的治療中已經起著不可忽視的作用.許多中藥具有抗腫瘤[1-3]的作用，毒性小于化療藥物，對正常組織細胞傷害小，與化療藥合用具有減毒增效的作用[4].落地生根（Bryophyllum pinnatum （L.f.） Oken）是景天科（Crassulaceae）落地生根屬（Bryophllurn Salisb）的一種多年生草本植物，在民間又有土三七、葉生根、花蝴蝶、番鬼牡丹或者天燈籠等別名[5].落地生根原產于非洲，現在我國多地區均有栽培，集中分布在云南、福建、臺灣及兩廣地區，主要用于園藝觀賞.落地生根價格低廉且易于栽培，全年均可采摘，全草可入藥，性酸，苦，寒，歸經肺、腎經，具有涼血、解毒消腫、拔毒生肌等功效，民間常用于止刀傷出血、咽喉腫痛、疔瘡、潰瘍或者中耳炎等[6].藥理學研究發現，落地生根具有止血、鎮痛、抗炎[7-8]、抗免疫[9]、抑菌[10-11]、抗氧化[12]等藥理作用，但其抗腫瘤作用鮮有報道.廣西是中草藥資源大省，落地生根資源豐富，本課題通過研究落地生根凍干粉對肝癌HepG2細胞、人腦膠質瘤U87細胞和前列腺癌DU145細胞增殖的影響，初步篩選對落地生根敏感的腫瘤細胞，為進一步研究落地生根抗腫瘤作用提供初步實驗依據.

1? ? 材料

1.1? ? 細胞

人肝癌HepG2細胞購于中科院細胞庫;人腦膠質瘤U87細胞株和人前列腺癌DU145細胞購于武漢博士德生物工程有限公司.

1.2? ?實驗試劑與藥品

DMEM培養基、RPMI-1640培養基、PBS、胎牛血清（FBS）、鏈霉素和青霉素（PS）、胰酶均購于上海雙洳生物科技有限公司;CCK-8試劑盒和Hoechst凋亡試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司.

落地生根：采自廣西壯族自治區柳州市市郊，經廣西科技大學醫學部天然藥物教研室陳君副教授鑒定為景天科（Crassulaceae）落地生根屬（Bryophllurn Salisb）落地生根（Bryophyllum pinnatum （L.f.） Oken）.

落地生根凍干粉[13]及儲備液配制：收集新鮮落地生根500 g，洗凈晾干后用榨汁機榨汁，汁液冷凍干燥后得凍干粉（BPFP）3.25 g.用培養基溶解制成10 mg/mL（相當于生藥量1 538.46 mg/mL）的儲備液，用時用培養基稀釋至所需質量濃度.

1.3? ? 儀器設備

超凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州凈化設備有限公司）;CO2恒溫細胞培養箱（144415-20371，? ? ? 美國Thermo公司）;熒光倒置顯微鏡（TS2-FL ECLIPSE，日本尼康株氏會社）;全波長掃描酶標板（Multiskan GO，美國Thermo公司）;立式高壓滅菌器（LDZF-50L-Ⅱ，上海申安醫療器械廠）.

2? ? 方法

2.1? ? 細胞體外培養

HepG2細胞培養在含10%的胎牛血清、? ? ? 100 U/mL鏈霉素和青霉素的DMEM完全培養基中;U87、DU145細胞分別培養在含10%的胎牛血清+ 100 U/mL鏈霉素和青霉素的RPMI-1640完全培養基中.細胞置于37 ℃、5% CO2恒溫細胞培養箱中培養，待細胞處于指數增長期且融合度達到80%～90%時，可進行實驗操作.

2.2? ? CCK-8法[14]檢測BPFP對HepG2、 U87、 DU145細胞增殖的影響

分別將對數生長期的HepG2、U87、DU145細胞，按每孔5 000～7 000個細胞接種于96孔培養板中，每組設4個復孔.待細胞貼壁后，分別用? ? ? ? ? 50 μg/mL、100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、 250 μg/mL（分別相當于生藥量7.69 μg/mL、15.38 μg/mL、23.08 μg/mL、30.77 μg/mL、38.46 mg/mL）的BPFP處理24 h、48 h和72 h，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑培養2 h，用酶標儀在450 nm處測定OD值，按照式（1）計算BPFP對細胞生長的抑制率.實驗重復3次.

（1）

2.3? ?Hoechst33258染色法[15]檢BPFP對HepG2、U87、DU145細胞凋亡的影響

為了研究BPFP影響人癌細胞的增殖是否與細胞的凋亡有關，進行了細胞凋亡實驗.將對數生長期的HepG2、U87和DU145細胞，按每孔約5 000個細胞接種于24孔板，細胞貼壁后分別用50 μg/mL、? ? 100 μg/mL、150 μg/mL、200 μg/mL、250 μg/mL的BPFP處理24 h，吸出培養基，按照Hoechst凋亡試劑盒說明操作，每孔加入200 μL固定液，固定? ?10 min，吸棄固定液，用PBS洗去固定液，避光加入Hoechst 33258染色5 min，吸棄染色液，用PBS洗去Hoechst 33258，加入1 mL PBS，在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞凋亡情況.

2.4? ? 數據處理

所有數據均以“均數±標準差”表示，采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理分析，兩組間差異比較采用t檢驗;采用GraphPad Prism 6.0軟件進行實驗圖片處理.

3? ? 結果

3.1? ? BPFP對肝癌HepG2細胞的影響

3.1.1? ? BPFP對HepG2細胞增殖的影響

圖1是不同質量濃度的BPFP分別在24 h、? ?48 h和72 h對HepG2細胞增殖的影響結果.從圖1中所顯示的數據可看出，各質量濃度BPFP對HepG2作用24 h時，細胞生長被抑制，但抑制程度不明顯;在作用48 h后，各質量濃度BPFP都能明顯抑制HepG2細胞生長，但其抑制程度與時間、劑量不呈依賴性.

3.1.2? ? BPFP對HepG2細胞凋亡的影響

圖2是HepG2細胞給予BPFP 24 h后加入Hoechst 33258染色在熒光倒置顯微鏡下所觀察到的結果.Hoechst 33258染色后，活細胞形態為圓形或橢圓形的正常藍色;而凋亡細胞因染色質固縮，其細胞核會呈致密濃染，顏色為亮藍色.從圖2可見，被固定住的細胞都已染色，與空白對照組 （0 μg/mL）比較，不同質量濃度BPFP處理后的HepG2細胞均不同程度出現亮藍色熒光，且BPFP質量濃度越高，藍色熒光越多且越明顯，這提示

3.2? ? ?BPFP對人腦膠質瘤U87細胞增殖的影響

3.2.1? ? BPFP對U87細胞增殖的影響

圖3是不同質量濃度的BPFP分別處理U87細胞24 h、48 h和72 h后細胞的生長抑制結果.由圖3可見，在給藥24 h內，BPFP對U87細胞增殖抑制 程度與作用劑量和時間呈依賴性;但在50 μg/mL時在不同時間點對細胞的生長抑制作用都不明顯;在100 μg/mL作用72 h和150 μg/mL以上濃度作用48 h時對U87細胞增殖抑制作用明顯增強，抑制率達80%以上，250 μg/mL作用72 h抑制率更是達到了100%.

3.2.2? ? BPFP對U87細胞凋亡的影響

圖4是U87細胞給藥24 h后經Hoechst 33258染色在熒光倒置顯微鏡下觀察細胞的結果.隨著BPFP質量濃度的增加，觀察到了更多細胞的染色質濃縮、核碎裂和凋亡小體，說明細胞凋亡與質量濃度呈依賴性.

3.3? ? BPFP對前列腺癌DU145細胞增殖的影響

3.3.1? ?BPFP對DU145細胞增殖的影響

圖5是不同質量濃度的BPFP處理DU145細胞24 h、48 h和72 h后細胞的生長抑制結果.由圖5可見，BPFP對DU145細胞增殖抑制作用不具有時間依賴性，但對劑量具有一定依賴性.200 μg/mL以下質量濃度的BPFP對細胞增殖的抑制作用都不明顯，但質量濃度達到250 μg/mL時對DU145細胞有明顯的抑制作用，作用48 h后對DU145細胞生長的抑制率達到了100%.

3.3.2? ?BPFP對DU145細胞凋亡的影響

圖6是DU145細胞經BPFP處理24 h并經Hoechst 33258染色后在熒光倒置顯微鏡下觀察的結果.BPFP在質量濃度200 μg/mL以下觀察到的凋亡細胞非常少，但質量濃度在250 μg/mL時亮藍色熒光明顯增強增多，說明凋亡細胞增多.

4? ? 討論與結論

通過實驗發現，BPFP對HepG2、U87和DU? 145細胞的增殖具有不同程度的抑制作用：不同質量濃度的BPFP處理HepG2細胞48 h后能夠明顯抑制細胞增殖，平均抑制率為87.33%;BPFP質量濃度為150 μg/mL及以上作用48 h后對U87細胞增殖抑制作用明顯增強，平均抑制率達83.19%;BPFP質量濃度為250 μg/mL作用DU145細胞48 h后增殖抑制作用達到100%.實驗結果表明，落地生根具有抗腫瘤作用，可作為抗腫瘤藥物進一步開發和研究.

細胞凋亡是真核細胞重要的生物學現象，在腫瘤治療中，誘導腫瘤細胞凋亡是重要的治療策略[16].細胞發生凋亡時，最先改變的是體積縮小，連接消失，胞質密度增加，線粒體膜電位降低，通透性增加，細胞色素C釋放到胞漿，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解為片段，形成凋亡小體[17]，最后被巨噬細胞吞噬.為了解BPFP抑制腫瘤細胞增殖的作用是否與細胞凋亡有關，本課題用Hoechst33258染色法觀察了BPFP處理3種細胞24 h后的染色情況.Hoechst 33258是一種可以穿透細胞膜的藍色熒光染料，用于細胞核染色.BPFP處理3種癌細胞24 h后用Hoechst33258染色，都能不同程度觀察到濃縮的核質及凋亡小體，細胞凋亡趨勢與細胞增殖抑制率趨勢一致.實驗結果表明，落地生根能通過促進細胞凋亡而產生抗腫瘤的作用.

綜上所述，落地生根對HepG2和DU145細胞的增殖抑制作用更為明顯，具有潛在的抗肝癌和前列腺癌的作用，可能與BPFP促進了細胞凋亡有關.下一步，課題組將對落地生根抗腫瘤作用的有效成分進行篩選，對落地生根促進腫瘤細胞凋亡的機制作進一步的研究，同時尋找落地生根對敏感腫瘤細胞的共同作用靶點.

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