喜樹堿對宮頸癌SiHa細胞的抑制作用及其機制探討

梁小婷,康慧琳

(1山西醫科大學汾陽學院醫學檢驗系,汾陽 032200;2孝義市人民醫院檢驗科;*通訊作者,E-mail:l568375113@163.com)

宮頸癌是威脅全球女性健康的常見惡性腫瘤之一,全球每年都有約二十幾萬的女性死于宮頸癌。近年來宮頸癌患者的年齡分布有明顯的走低趨勢[1],對女性的身心健康造成很大的影響,也為家庭帶來很重的經濟負擔[2]。常規傳統的宮頸癌臨床治療方案包括手術切除、放射療法、化學療法或采取綜合性的系統治療手段[3]。隨著醫學技術水平的發展,運用而生多種宮頸癌的新型治療手段,比如分子靶向治療、免疫治療等多種治療手段[4]。早期的宮頸癌患者的治療效果較好,生存率較高。對于晚期以及持續性和復發性患者來說治療效果較差[5]。其中化學療法目前主要用于新輔助化療、增敏化療、術后或放化療后的輔助治療、姑息性化療等[6]。近年來隨著新型化療藥物的不斷出現,給藥途徑和方法的不斷改進,化學療法在治療宮頸癌中取得了很好的療效[7]。因此研究和開發新型化療藥物,對于維持女性的宮頸健康有著非常重要的意義。

喜樹堿(camptothecin,CPT)來源于珙桐科植物喜樹,是一種從喜樹中提取出的五環吲哚生物堿[8]。CPT是一種傳統的化療藥物,廣泛地應用于多種癌癥,例如白血病、肝癌、胃癌、結直腸癌、肺癌等[9]。CPT主要通過抑制拓撲異構酶Ⅰ(Topo Ⅰ)影響DNA的復制,進而促進細胞凋亡。雖然CPT可以作用于多種癌癥,但是關于CPT作用于宮頸癌的報道較少,尤其是對于人子宮頸鱗癌細胞SiHa鮮有報道,對其作用機制也尚未闡明。因此本研究為了明確CPT對SiHa細胞的促凋亡作用,并初步探討CPT作用于SiHa細胞的分子機制,為臨床上進一步研究CPT的抗癌機制和應用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

喜樹堿(CAS號:7689-03-4)購于上海阿拉丁公司;二甲基亞砜(DMSO)、MTT粉劑、Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡檢測試劑盒均購于北京索萊寶公司;DAPI染液購于武漢博士德公司;Trizol試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR Green Ⅰ試劑盒購于北京全式金公司。

1.2 儀器

多功能自動酶標儀購于美國伯騰公司;流式細胞儀購于美國BD公司;熒光顯微鏡購于日本尼康公司;核酸定量儀購于北京普析通用公司;熒光定量PCR儀購于美國賽默飛公司。

1.3 細胞株

人子宮頸鱗癌SiHa細胞系山西醫科大學第一醫院饋贈。胎牛血清、胰酶、青-鏈霉素和細胞培養基DMEM(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.4 細胞培養與分組

細胞培養采用DMEM高糖培養基,其中加入10%的胎牛血清,1%的青-鏈霉素。在37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。倒置顯微鏡觀察細胞生長至80%融合左右,進行細胞傳代與實驗。設置對照組(常規培養組)和不同濃度喜樹堿(CPT)處理組,不同濃度喜樹堿處理組在常規培養基中加入1,5,10,50 μmol/L的喜樹堿。

1.5 MTT法檢測細胞增殖活性

取對數生長期的SiHa細胞制備成1×104個/ml單細胞懸液,以每孔100 μl接種在96孔板中,邊緣孔中加入無菌PBS,防止實驗操作孔中水分蒸發影響實驗結果,同時設置空白孔,空白孔中不添加任何液體。將培養板放入細胞培養箱,待細胞貼壁后棄去上清。對照組每孔中加入100 μl DMEM細胞培養基,實驗組中加入100 μl含喜樹堿的DMEM培養基,使得喜樹堿的終濃度為1,5,10,50 μmol/L。將96孔板放入細胞培養箱中,干預24 h或48 h取出,每孔加入10 μl MTT,4 h后棄去上清,加入150 μl DMSO,用酶標儀測定培養板在570 nm處的吸光度值。計算公式:細胞存活率=[(A實驗孔-A空白孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%;細胞抑制率=[(A對照孔-A實驗孔)/(A對照孔-A空白孔)]×100%。以上實驗重復3次。

1.6 熒光染色法觀察細胞核形態學變化

取對數生長期的SiHa細胞制備成1×105個/ml單細胞懸液,以每孔2 ml接種于6孔板中,將6孔板放入細胞培養箱中預培養24 h后棄去上清。對照組加入2 ml細胞培養基,實驗組分別加入終濃度為5,10,50 μmol/L的喜樹堿細胞培養液。加藥干預24 h,取出6孔板,棄去上清,用PBS緩慢沖洗細胞表面2次,用4 ℃的多聚甲醛固定15 min。固定后用PBS輕輕洗滌3次,每次5 min,注意不要沖洗掉細胞。避光的條件下加入濃度為0.1 μg/ml的DAPI染液15 min,染色后劇烈洗滌3次,每次5 min。熒光顯微鏡波長340 nm下觀察SiHa細胞的形態學變化。

1.7 流式細胞術檢測細胞凋亡

與1.6同樣的方法處理細胞。加藥干預24 h,取出6孔板,棄去上清,用PBS緩慢沖洗細胞表面2次。使用Binding buffer將細胞重懸成1×105個/ml的細胞懸液。在細胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC染液,室溫、避光10 min后加入PI染液,避光孵育后加入Binding buffer,上機檢測。

1.8 real-time PCR檢測凋亡相關基因mRNA表達水平變化

與1.6同樣的方法處理細胞。加藥干預24 h,采用TransZol Up法提取各組細胞內的總RNA。將RNA反轉錄為cDNA,使用核酸定量儀定量,調整合適的反應溫度及時間(94 ℃先預變性30 s;94 ℃再變性5 s;50-60 ℃退火15 s,72 ℃延伸10 s,共40-45個循環),然后上機。通過實時熒光定量PCR法比較各組間細胞內GADPH、Bax、Bcl-2基因的表達含量。引物序列見表1。

表1 擴增引物序列表

1.9 統計學處理

2 結果

2.1 喜樹堿對SiHa細胞的生長抑制作用

MTT結果顯示,CPT作用于SiHa細胞24,48 h,可以明顯地抑制SiHa細胞的生長,與對照組相比,CPT組細胞存活率明顯下降,差異均有統計學意義(P<0.01)。且各濃度組之間的差異有統計學意義(均P<0.05,見圖1,2),呈劑量依賴性。

與對照組相比較,**P<0.01;與1 μmol/L CPT組相比,#P<0.05;與5 μmol/L CPT組相比,△△P<0.01;與10 μmol/L CPT組相比,&P<0.05

與對照組相比較,**P<0.01;與1 μmol/L CPT組相比,##P<0.01;與5 μmol/L CPT組相比,△P<0.05;與10 μmol/L CPT組相比,&P<0.05

2.2 喜樹堿對SiHa細胞核形態學影響的檢測

SiHa細胞經不同濃度的CPT(5,10,50 μmol/L)處理后,采用熒光顯微鏡檢測細胞核的形態變化。經CPT處理后,SiHa細胞的細胞核出現濃染,細胞核開始固縮,隨著CPT濃度的不斷加大,核固縮較明顯,50 μmol/L的CPT作用于SiHa細胞后,細胞核進一步濃縮,顏色發白呈亮藍色,部分細胞核出現核碎裂,顯示出典型凋亡細胞的核特征(見圖3)。表明CPT可以導致SiHa細胞出現明顯的細胞凋亡的形態學特征。

圖3 不同濃度的CPT對SiHa細胞核形態學的影響

2.3 喜樹堿對SiHa細胞凋亡率影響的檢測

為了進一步量化凋亡作用,采用流式細胞術檢測經Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染的細胞。結果顯示,與對照組相比,CPT組凋亡率明顯高于對照組,差異均有統計學意義(P<0.01)。在0-50 μmol/L的濃度范圍內隨著濃度的增大細胞凋亡率也在不斷增高,各濃度組之間的差異有統計學意義(均P<0.01,見圖4,表2),呈劑量依賴性。

圖4 不同濃度的CPT對SiHa細胞凋亡率的影響

表2 CPT作用于SiHa細胞24 h后細胞的凋亡率

2.4 喜樹堿對SiHa細胞凋亡基因mRNA表達水平的影響

不同濃度的CPT(1,5,10,50 μmol/L)作用于SiHa細胞后,Bax基因的表達呈增長趨勢,與對照組相比較,差異均有統計學意義(P<0.05,見圖5)。在0-50 μmol/L的濃度范圍內隨著濃度的增大細胞內Bax基因的表達也在不斷增高,各濃度組之間的差異有統計學意義(均P<0.05,見圖5),呈劑量依賴性。

與對照組相比,*P<0.05;與1 μmol/L CPT組相比,#P<0.05;與5 μmol/L CPT組相比,△P<0.05;與10 μmol/L CPT組相比,&&P<0.01

相反,與對照組相比,Bcl-2基因的表達呈下降趨勢,不同濃度CPT組差異均有統計學意義(P<0.05,見圖6)。在0-50 μmol/L的濃度范圍內隨著濃度的增大細胞內Bcl-2基因的表達也在不斷降低,各濃度組之間的差異有統計學意義(均P<0.05,見圖6),呈劑量依賴性。

與對照組相比,*P<0.05;與1 μmol/L CPT組相比,#P<0.05;與5 μmol/L CPT組相比,△P<0.05;與10 μmol/L CPT組相比,&P<0.05

3 討論

宮頸癌是威脅全球女性健康的一類重大疾病。根據美國癌癥協會報道,2020年美國宮頸癌患者將會新增加13 800例,預計死亡人數達到4 290例[10]。宮頸癌的治療方法主要有手術、放療和化療。近年來抗癌化學藥物的迅猛發展,過去認為對宮頸癌無效的化療現在已經被認為是非常重要的一種治療方式,尤其是宮頸癌晚期或者復發者效果顯著[11]。

細胞凋亡是指由基因決定的細胞自動結束生命的過程,主動而有序,整個過程受到嚴格的遺傳機制的調控[12]。凋亡產生的損傷作用是癌癥治療的較為有效的重要思路。喜樹堿是一種植物抗癌藥物,對多種腫瘤細胞均有抑制生長的作用[13]。研究表明,喜樹堿可以誘導多種細胞發生凋亡,例如胃腸道癌癥和頭頸部癌癥。也有研究報道,喜樹堿對宮頸癌細胞有明顯的抑制生長的作用,但多為研究喜樹堿或羥基喜樹堿對HeLa細胞的作用[14,15]。目前喜樹堿對宮頸鱗癌SiHa細胞的研究報道較少[16],探究其作用機制的文章更少。為了研究喜樹堿對宮頸鱗癌SiHa細胞的影響,采用MTT法將不同濃度的喜樹堿作用于SiHa細胞并觀察其生長狀況。實驗結果表明,不同濃度的喜樹堿對SiHa細胞有明顯的抑制作用,并且呈現一定的劑量依賴性。進一步研究喜樹堿對SiHa細胞的抑制作用是否通過抑制細胞凋亡來產生,進而進行了形態學實驗。研究表明,喜樹堿作用與SiHa細胞后,出現典型的凋亡特征,核分裂的染色質凝聚,并逐漸出現凋亡小體。為了進一步量化細胞凋亡率,Annexin Ⅴ/PI雙染后采用流式細胞術檢測細胞凋亡率。不同濃度的喜樹堿作用于SiHa細胞后,細胞凋亡率明顯升高,與對照組相比較差異具有統計學意義。

Bcl-2家族蛋白包含抗凋亡蛋白(主要包括Bcl-2、Bcl-xL等)和促凋亡蛋白(主要包括Bax、Bak等)[17]。Bax和Bcl-2是線粒體通路中的關鍵調節蛋白。當細胞受到凋亡信號刺激時,Bax轉移到線粒體上,并使線粒體發生變化進而促使細胞凋亡。整個過程中Bcl-2必須與Bax結合才能發揮作用。研究表明,Bcl-2表達升高,Bax表達下降,兩者形成異二聚體抑制細胞凋亡。反之,兩者形成同二聚體促進細胞凋亡[18]。本實驗中,不同濃度的喜樹堿作用于SiHa細胞后,Bcl-2的表達降低,Bax的表達升高,說明喜樹堿可能通過線粒體通路促進SiHa細胞凋亡,進而抑制SiHa細胞的生長。但是實驗沒有進一步從蛋白水平驗證,有待于進一步的完善。

總之,本研究證明,喜樹堿作用于宮頸鱗癌SiHa細胞,可以顯著地抑制SiHa細胞的生長。其作用機制可能通過線粒體通路促進SiHa細胞發生凋亡,為臨床中宮頸癌的治療提供了一定的基礎實驗依據。