HPLC法測定復方參龍膠囊中5個功效成分的含量

高亞亞,柴旭兵,閆 俊,葉 楠,曹團平,楊 瑩,封 婷

(1西安市第五醫院神經內科,西安 710082;2榆林市第一醫院神經內科;*通訊作者,E-mail:fengting1126@126.com)

腦梗死是一種臨床中常見的腦血管疾病,主要是由于腦血管血栓形成導致腦組織供血供氧不足引起的[1],具有高致殘率、高致死率的特點。一般臨床中將其分三種類型即腦血栓、腔隙性梗死、腦栓塞,該疾病由于起病急、發展快,在短時間內可造成腦組織壞死或軟化,其預后較差,存在偏癱、失語等多種并發癥[2-4]。目前由于人們生活方式變化,不注重飲食習慣,其發病率越來越高,發病率約占血管性癡呆總發病率的8%-12%[5-7]。在臨床治療上,采用常規治療方式盡管在早期能夠實現溶栓,減少神經功能損傷,但臨床中所收治的患者多數錯過了溶栓時間窗,再進行常規治療的效果不甚理想。所以亟需尋找理想治療方法,中藥為我國傳統醫藥,能通過多環節、多途徑、多靶點對疾病進行全面治療[8]。復方參龍膠囊為本院臨床運用多年的院內制劑,由西洋參、三七、黃芪、遠志、當歸等組成,治療腦梗死臨床療效反應良好。因此,筆者采用高效液相色譜法檢測該制劑主要功效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd,為該制劑建立質量控制方法,亦為該制劑的動物藥代動力學和組織分布研究奠定了基礎;同時功效成分的檢出與定量亦為臨床運用提供科學依據。

1 儀器與試藥

島津高效液相色譜儀(Prominence LC-2030,帶自動進樣器,LC/Labsoluion色譜工作站),日本島津公司;Shim-pack VP-ODS液相色譜柱:Intersil C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm,島津技邇上海商貿有限公司經);ME235S型電子分析天平,德國塞多利斯公司;KQ-5200DE型數控超聲波發生器,昆山超聲儀器有限公司。對照品:三七皂苷R1(批號:110745-201921,含量90.4%)、人參皂苷Rg1(批號:110703-201933,含量93.4%)、人參皂苷Re(批號:110754-202028,含量以93.9%)、人參皂苷Rb1(批號:110704-202028,含量93.1%),人參皂苷Rd(批號:111818-201603,含量92.1%),均購自中國藥品食品檢定研究院;復方參龍膠囊(批號170108、170109、170110,規格0.4 g/粒)為西安市第五醫院藥劑科制備;超純水(由美國密理博純水儀制備,美國密理博公司);乙腈、甲醇均為HPLC級,美國Fisher公司;其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動相:乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液溶液(B),梯度洗脫見表1。記錄時間為100 min。體積流量:1.0 ml/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:203 nm;進樣量:10 μl;理論板數按人參皂昔Rb1峰計算應不低于4 000[9]。

表1 梯度洗脫表

2.2 混合對照品溶液的配制

分別精密稱取三七皂苷R1 5.00 mg、人參皂苷Rg1 8.00 mg、人參皂苷Re 7.00 mg、人參皂苷Rb1 10.00 mg,人參皂苷Rd 6.50 mg置于10 ml量瓶中,加甲醇定溶至刻度,搖勻,即得混合對照溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取20粒本品,傾出內容物,研細,混勻,稱取粉末5 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入50 ml甲醇,稱定重量,放置過夜,超聲處理(功率250 W,頻50 kHz)30 min,放涼,用甲醇補足減失的重量,搖勻,靜置,再用0.45 μm微孔濾膜濾過,取續濾液,即得。

2.4 陰性對照溶液的制備

按處方比例,分別制備缺西洋參和三七模擬制劑,再分別按“2.2.3”項制備陰性對照溶液。

2.5 標準曲線及線性范圍

分別精密量取混合對照品0.05,0.10,0.20,0.04,0.80,1.00 ml,分別置于各個1 ml的量瓶中,加甲醇定容至1 ml,分別得混對照品溶液1,2,3,4,5,6。進樣測定,記錄峰面積,考察對照品濃度(x)與峰面積(y)的線性關系,結果各種成分在相應的濃度范圍內具有良好的線性關系(見表2)。

表2 對照品的線性方程及其濃度范圍

2.6 專屬性實驗

按2.1項色譜條件分別進樣陰性對照溶液、供試品溶液、混合對照溶液,結果陰性對照均無干擾,見圖1。

1.三七皂苷R1;2.人參皂苷Rg1;3.人參皂苷Re;4.人參皂苷Rb1;5.人參皂苷Rd

2.7 精密度實驗

取混合對照品溶液4,連續測定6次,進樣測定峰面積,計算RSD值。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的RSD分別為0.82%,0.95%,0.89%,1.04%和1.01%,說明儀器精密度良好。

2.8 穩定性實驗

使用混合對照品溶液4,分別于0,2,4,8,12,24 h,進樣測定峰面積,計算RSD值。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的RSD值分別為1.03%,0.96%,0.97%,1.21%和1.12%,說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.9 重復性實驗

稱取樣品(批號170108)5 g,精密稱定,按上述2.3項供試品制備方法制備6份供試品溶液及按2.1項色譜條件測定。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的RSD值分別見表3,結果顯示儀器重復性良好。

表3 重復性測定結果

2.10 加樣回收率

稱取樣品(批號170108)5 g,精密稱定,精密稱定6份,分別按表4添加對照品溶液,依據上述2.3項供試品制備方法與2.1項色譜條件測定。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的平均回收率和RSD值見表4,結果顯示本方法回收率良好。

表4 加樣回收率測定結果 (未完待續)

2.11 樣品含量測定

按照供試品制備方法制備樣品溶液,按照上述檢測方法測定三批中試樣品中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1,人參皂苷Rd的含量,結果見表5。

表5 三批復方參龍膠囊5種成分測定結果 (mg/g)

3 討論

復方參龍膠囊由西洋參、三七、黃芪、遠志、當歸、菖蒲、熟地黃、川芎等中藥組成,經醇提、減壓干燥、生藥粉入藥等工藝制成膠囊,具有益氣活血、醒腦開竅等作用。文獻報道黃芪、菖蒲、當歸、川芎等,可抑制腦缺血再灌注損傷后的細胞壞死和凋亡、炎癥反應等[10-12];遠志有保護心腦血管、抗癡呆、增強學習記憶等藥理活性[13]。三七含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等5種成分[14],西洋參含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等4種人參皂苷[9,15-18]。西洋參與三七均具有神經保護,抑制神經細胞凋亡、促進損傷修復等作用[19-24]。三七皂苷R1與人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd均有保護心血管系統、中樞神經系統等作用[25-28],因此,對制劑中功效成分三七皂苷R1與人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd等分析與定量很有必要。

采用PDA檢測器對復方參龍膠囊樣品所測成分三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的紫外吸收曲線在200-400 nm波長范圍內進行掃描,結果發現在203 nm波長處均具有最大吸收,同時依據各峰的面積值與分離度及文獻[9]報道結果,選擇203 nm作為檢測波長。由于該制劑為中藥復方,成分復雜,存在水溶性、脂溶性成分等極性差異,所以采用梯度洗脫的方法。選用不同品牌與規格的色譜柱如Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱、Kromasil C18(150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、Hypersil GOLD C18(150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、ZORBAX SB-C18150 mm和250 mm×4.6 mm,5 μm)、Thermo ODS C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,結果Shim-pack C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱較理想。比較了不同流動相系統甲醇(乙腈)-水、乙腈(甲醇)-磷酸水溶液(0.05%,0.1%,0.5%,0.8%)、乙腈(甲醇)-醋酸水溶液(0.2%,0.6%,0.8%)、乙腈(甲醇)-甲酸水溶液(0.1%,0.2%,0.5%)。結果,流動相系統以乙腈-0.1%磷酸水溶液系統為最佳,其圖譜上各個色譜峰的分離度與保留時間較符合要求,所以選乙腈-0.1%磷酸水溶液系統作為流動相系統。對不同柱溫(26,30,36,40 ℃)與流速(0.6,0.8,1.0,1.2 ml/min)進行比較,結果選擇便于控制的柱溫30 ℃,流速1.0 ml/min較為理想;色譜記錄時間在100 min之后,無色譜峰出現。因此,選記錄時間為100 min。

對供試品制備方法進行了研究,由于本制劑采用共比例乙醇提取,而西洋參與三七為生藥粉入藥,同時比較了甲醇、水、50%甲醇作為溶劑,處理方法采用超聲(15,30,45,60 min,功率250 W,頻率50 kHz與100 kHz)與加熱回流(30,45,60 min);結果采用甲醇作為溶劑,超聲30 min,功率250 W,頻率50 kHz為宜。

專屬性研究,因三七含有三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等5種成分,西洋參含有人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd等4種人參皂苷,所以選擇同時缺西洋參與三七制備模擬制劑。

綜上所述,建立了復方參龍膠囊成分的HPLC分析方法,測定了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd的含量,該方法專屬性強、重復性好、穩定簡便、回收率高,可作為本品的質量控制方法,亦為該制劑的動物藥代動力學和組織分布研究奠定了基礎,同時功效成分的檢出與定量亦為臨床運用提供科學依據。