TLR4在抵抗生殖道感染過程中對小鼠卵泡發育的影響

丁 旭,李愛莉,唐雪原,周冬梅,黃艷紅*

(1西北大學附屬西安國際醫學中心醫院生殖內分泌科,西安 710100;2西北大學附屬西安高新醫院生殖醫學科;*通訊作者,E-mail:huangyanhongphd@163.com)

女性生殖道感染(reproductive tract infection,RTI)導致的卵巢功能衰退受到廣泛關注。沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis)是經性傳播導致生殖感染的最常見感染源,女性衣原體感染的患病率為3.0%-5.3%[1,2]。在缺乏免疫細胞干預的情況下,卵巢感染會干擾優勢卵泡的發育和類固醇激素的生物學合成,紊亂卵巢微環境引起生育障礙。TLRs(Toll-like receptors)系統是機體抵抗感染的第一道免疫防線,TLR4能夠識別衣原體細胞壁的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導抵抗感染的慢性炎癥反應。當TLR4識別病原微生物后,卵母細胞的發育和成熟是否會受到影響尚未可知。在果蠅中,最先發現Toll基因還能夠調節細胞遷移和卵子的形成[3]。在哺乳動物中,LPS/TLR4系統在原始卵泡中介導炎癥反應,降低哺乳動物的卵巢儲備,從而降低生育力[4]。

LPS/TLR4通路是抗生殖道感染過程中的重要通路,對卵泡發育有十分重要的影響,闡明TLR4通路調節卵巢微環境影響卵泡發育的分子機制,為女性生育力衰退的診治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選擇未交配的健康雌性性成熟BALB/c小鼠(北京維通利華實驗動物技術有限公司)6-8周齡,體質量25-30 g。

1.2 主要試劑

LPS購自Sigma-Aldrich公司(美國)。PBS購自HyClone公司(美國)。雌激素檢測試劑盒購自碧云天公司(中國)。cDNA逆轉錄試劑盒和real time qPCR用熒光定量PCR試劑SYBR GreenⅠ均購自TOYOBO公司(日本)。

1.3 在體實驗

采用LPS感染陰道黏膜法[5],簡述如下。36只小鼠隨機分成3組:未處理組、PSB組和LPS組,每組12只小鼠。LPS組每只小鼠的陰道注入50 μl的LPS(終劑量為20 μg/kg),原位停留1-2 min,防止液體溢出。未處理組注射前及其他兩組注射后24 h頸椎脫臼處死各組小鼠,觀察記錄LPS組小鼠陰道紅腫情況、子宮體有充血肥大表現。摘取卵巢并稱重,PBS清洗兩次后,一部分卵巢用4%多聚甲醛固定,另一部分放入Trizol中于-80 ℃保存備用。本動物實驗方案已被西北大學實驗動物管理與福利倫理委員會認定,符合動物處理、保護等相關倫理要求。

1.4 卵泡計數

4%多聚甲醛固定的樣本,常規石蠟包埋,制備切片,HE染色后進行卵泡計數。每隔2個組織片卵泡計數一次,為避免多計或漏計,只統計有細胞核的卵泡的數量。不同階段的卵泡分開統計。

1.5 離體實驗

取正常小鼠的卵巢,于MEM-α培養基(含3 mg/ml BSA,0.23 mmol/L丙酮酸,0.03 IU/ml FSH)中在5% CO2培養箱中培養,隨機分為2組。LPS刺激組:加入等體積的LPS刺激劑,使其終濃度為0.1 μg/ml和1 μg/ml;對照組:加入相同體積的培養液。繼續培養6 h后,將卵巢組織于4%多聚甲醛固定,另一部分卵巢組織于Trizol中裂解,收集培養液上清,備用。

1.6 real time qPCR檢測mRNA水平的表達

提取小鼠卵巢組織的RNA經反轉錄所得cDNA為模板,按照SYBR GreenⅠ預混液說明書,采用10 μl的反應體系,以β-actin作為內參對照,TLR1-9所用引物參考文獻[6,7],IL-1β、IL-6和IL-8等引物見表1。采用ABI 7900實時熒光定量PCR儀,檢測Ct值。PCR反應條件為:95 ℃,10 min;40循環(94 ℃,15 s;55 ℃,30 s;72 ℃,30 s);95 ℃,15 s;60 ℃ 15 s,95 ℃ 15 s。所有樣本均設定3個復孔對照。

表1 實時熒光定量PCR引物

1.7 ELISA檢測

采用競爭法ELISA(Competitive ELISA),參考試劑盒說明書步驟檢測離體實驗上清中雌二醇(E2)的濃度。

1.8 統計學分析

引物設計所用軟件為Primer Premier 5.0版本。繪圖及統計學分析使用Graphpad軟件。計量資料用平均值±標準差的形式表示,兩組間比較用獨立樣本t檢驗。TLRs的表達模式的組間比較采用One-way ANOVA單因素方差統計學分析。當P<0.05時認為差異有統計學意義。real time qPCR結果采用比較Ct值法(2-ΔΔCt)表示,即:改變的倍數(fold)=2-ΔΔCt,其中ΔΔCt=(處理組Ct靶基因-處理組Ct內參)-(未處理組Ct靶基因-未處理組Ct內參)[8,9]。

2 結果

2.1 生殖道感染對小鼠卵泡發育的影響

LPS感染后,統計卵巢中原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、竇卵泡和閉鎖卵泡數目占總卵泡數的百分比。結果顯示,LPS組卵巢中的原始卵泡數目比率顯著低于未處理組,差異有統計學意義(23.60%±5.73%vs71.00%±4.06%,P<0.01);LPS組的閉鎖卵泡數目比率顯著高于未處理組,差異有統計學意義(9.60%±3.78%vs4.80%±1.92%,P<0.01);LPS組的初級卵泡比率顯著高于未處理組,差異有統計學意義(51.80%±7.95%vs13.20%±3.11%,P=0.035,見圖1)。表明LPS引起的生殖道感染過程中,加快了原始卵泡消耗,加速了卵泡閉鎖。

與未處理組相比較,*P<0.05,***P<0.001

2.2 生殖道感染后TLR成員在卵巢中的表達模式

生殖道感染后,real time-qPCR技術分析TLR成員在小鼠卵巢中的表達。根據得到的Ct值,選取表達量相對較低的TLR9為基準,采用2-ΔΔCt法計算表達倍數。2-ΔΔCt值越大表示其在卵巢中的表達水平越高。結果顯示,在LPS感染后的小鼠卵巢中,TLR4與其他TLR成員相比呈現較高水平的表達(P<0.05,見圖2)。表明TLR4在LPS誘導的生殖道感染小鼠卵巢中發揮一定的功能。

與TLR1相比較,*P<0.05

2.3 TLR4抵抗生殖道感染的炎癥因子變化和雌二醇變化

根據real time qPCR數據計算出2-ΔΔCt值,表示LPS刺激組與對照組中炎癥因子表達水平的相對倍數關系。2-ΔΔCt值越高,表示LPS刺激組的炎癥因子的表達與對照組相比升高越明顯。結果顯示,0.1 μg/ml和1 μg/ml LPS刺激組IL-1β的mRNA表達均高于對照組,差異有統計學意義(P分別為0.029 8,0.002 2,見圖3)。0.1 μg/ml LPS刺激組IL-6的mRNA表達高于對照組,差異有統計學意義(P=0.003 7,見圖3)。0.1 μg/ml和1 μg/ml LPS刺激組IL-8的mRNA表達均高于對照組,差異有統計學意義(P分別為0.003 5,0.007 6,見圖3)。

ELISA檢測結果發現,1 μg/ml LPS刺激組的E2水平低于對照組,差異有統計學意義(P=0.029 6,見圖3)。

與對照組相比較,*P<0.05,**P<0.01

3 討論

TLRs系統是機體抵抗感染的第一道免疫防線。沙眼衣原體是引起生殖道感染的主要病原體,其細胞壁的主要成分LPS是TLR4識別的關鍵配體。感染后,TLR4主要誘導MyD88依賴性通路,將MyD88接頭蛋白募集到沙眼衣原體附近,之后再結合IRAK4激酶,引起轉錄因子NF-κB的激活入核,介導多種促炎細胞因子的產生,如IL-6、TNF-α,IL-1β等。由于單獨的TLR4的突變或敲除實驗并不能導致小鼠的不孕[10],因此生殖道感染后TLR4是如何影響卵巢功能的問題有待解決。

在哺乳類中,TLR4在顆粒細胞和卵丘細胞中表達[11]。本研究顯示LPS的刺激能增加卵泡的閉鎖,降低E2的分泌。對大鼠的研究結果也顯示LPS的刺激引起顆粒細胞凋亡,降低顆粒細胞的E2水平[12]。E2對卵泡的發育至關重要,E2水平間接反應卵泡成熟度和卵子質量[13]。由于顆粒細胞的主要功能是調節類固醇激素(如雌激素、孕激素)的合成。卵泡膜細胞產生雄激素后經顆粒細胞CYP19芳香化作用轉化為雌激素(主要為E2),為卵母細胞提供營養物質。因此,顆粒細胞中TLR4信號通路迅速激活天然免疫反應,同時也抑制芳香化酶CYP19的表達進而抑制類固醇激素(如E2)的合成[4],這是造成LPS感染會擾亂卵泡生長的潛在原因之一。

本研究結果發現,LPS感染在加速小鼠卵泡閉鎖的過程中,活化的TLR4系統TLR4參與免疫調節引起了炎癥因子(IL-1β,IL-8,IL-6)的大量積累。有研究表明TLR4能夠引起卵丘—卵母細胞復合體(cumulus cell oocyte complex,COC)表達高水平的IL-6和IL-8[4]。IL-6是一個多效性的細胞因子,調控細胞分化抑制顆粒細胞E2的分泌[14]。IL-8參與了卵泡的發育與閉鎖、排卵、激素生成及黃體功能[15]。IL-6和IL-8等細胞因子在多個物種的正常排卵過程中都發揮重要作用,誘導卵丘細胞的多種基因的表達,并刺激卵丘細胞團的增生從而修復排卵后的破損部位[16]。TLR4在卵巢感染后借由IL-6和IL-8發揮促進黃體生成的作用,這可能是感染與不孕并發表象的內在機制之一,值得深入研究。

TLR4在生殖道感染后迅速做出反應,誘導炎癥因子表達,調節了雌激素的分泌,從而影響卵泡發育。研究TLR4通路在引起免疫應答的同時參與卵泡發育過程中的生物學調控的分子機制,對解決因生殖道感染導致的不孕不育的臨床問題有重要的指導意義。