CD147在口腔鱗狀細胞癌中的表達及其對細胞增殖的影響

王 倩,于新新,董 明*

(1大連醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院口腔內科學教研室,大連 116044;2大連醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院;*通訊作者,E-mail:448148894@qq.com)

頭頸部癌(head neck cancer,HNC)是常見的惡性腫瘤,包括起源于鼻竇、鼻腔、口腔、咽、喉等部位的上皮性惡性腫瘤,占惡性腫瘤的6%,病理類型幾乎均為鱗癌[1,2]。作為全球第六大常見癌癥,頭頸部鱗狀細胞癌(head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)的最新發(fā)病病例超過30萬,全球死亡人數(shù)超過14萬[3]。口腔鱗狀細胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是口腔最常見的癌癥,占口腔癌的90%以上。盡管隨著醫(yī)療水平的提高,OSCC患者的生存質量已顯著提高,但由于手術后局部復發(fā)和遠處轉移,總體預后仍然較差[4,5]。現(xiàn)階段OSCC患者的治療方案幾乎都是基于腫瘤分期和潛在位置制定的,而對標OSCC潛在生物學特性的治療方案卻較為鮮見[6],因此,從分子水平來了解OSCC進展機制,檢測其生物標志物,或可為OSCC的預防及治療提供新的思路和方向。CD147(cluster of differentiation 147)是一種隸屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白,也稱為細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子,其廣泛表達于多種組織中,并在諸多惡性腫瘤細胞中高表達[7-9]。最近的研究表明CD147的過度表達與癌細胞增殖、侵襲和轉移有關[10],此外CD147還與腫瘤抗藥性有關聯(lián)[11]。雖然有關CD147促進腫瘤的分子機制已在某些癌癥中進行了研究,但其在OSCC中的表達和具體作用機制仍不明確,本文旨在探討CD147是否參與OSCC發(fā)生以及在其發(fā)展中所起到的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 組織樣本采集及分組

本研究在2017年9月至2018年12月期間,于大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院收集12例頭頸部鱗癌患者,取鱗癌(OSCC)組織及癌旁組織作為實驗樣本。患者年齡為56-83歲,8例為男性,4例為女性。每個病例所采集到的樣本均需分為三部分進行實驗,即CD147基因表達檢測、CD147蛋白的Western blot檢測和免疫組織化學檢測。所有患者均已簽署知情同意,實驗獲得倫理委員會批準。

1.3 免疫組化檢測CD147的表達

將組織切片依次靜置于無水二甲苯,無水乙醇,95%乙醇無水乙醇,85%乙醇無水乙,75%乙醇無水乙醇。在PBS中靜置5 min×3次,滴加山羊血清封閉液。孵育兔抗人CD147抗體(稀釋比1 ∶100),37 ℃室溫1 h,繼而孵育中山金橋SP9001二抗(稀釋比1 ∶100),37 ℃放置15 min,加DAB顯色劑,封片。將載玻片放置于顯微鏡下觀察并隨機選取10個視野拍照并使用Image-J軟件分析統(tǒng)計。

1.4 Western blot檢測CD147的表達

將組織轉移至研缽中研磨成粉,加蛋白裂解液,持續(xù)研磨后移入1.5 ml EP管中,提取蛋白質,按照BCA法對蛋白質進行定量。常規(guī)Western blot電泳、轉膜及封閉后,孵育兔抗人CD147抗體(稀釋比1 ∶1 000),GAPDH抗體(稀釋比1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜。繼而孵育山羊抗兔熒光二抗(稀釋比1 ∶500)1 h,使用Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System發(fā)光。

1.5 細胞培養(yǎng)

凍存的人口腔鱗癌細胞UM-SCC6經(jīng)復蘇后,在DMEM培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2、濕度90%的條件下傳代培養(yǎng)。

1.6 細胞轉染CD147-siRNA

將UM-SCC6細胞以103個每孔鋪于兩組1 ml的無血清無雙抗培養(yǎng)基中,按照說明書分別將CD147-siRNA及NC空載體加入兩組細胞及轉染試劑中,輕輕混勻后,室溫靜置15-20 min,37 ℃ CO2培養(yǎng)箱中孵育10 h左右,更換有血清及雙抗的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,所得兩組細胞分別命名為CD147-siRNA組及NC組。real-time PCR檢測轉染效率。

1.7 CCK-8實驗檢測CD147對口腔鱗癌細胞增殖的影響

轉染后24 h,分別將CD147-siRNA組及NC組細胞按照100 μl/103個每孔鋪于96孔板中培養(yǎng),每個樣本做3個復孔。按照實驗時間,分別在24,48,72 h后,棄培養(yǎng)基,每孔加入100 μl無雙抗無血清的培養(yǎng)液和10 μl CCK-8試劑。孵箱培養(yǎng)2 h之后,酶標儀測定OD450值。

1.8 集落形成實驗檢測CD147對口腔鱗癌細胞增殖的影響

按照每皿含500個細胞的濃度接種5 ml細胞懸液到培養(yǎng)皿中,按照十字的方向輕輕晃動培養(yǎng)皿,使細胞能夠分散均勻。將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-2周,當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時,加入結晶紫染液染色15 min,觀察染色的克隆數(shù)量。

1.9 Ki67實驗檢測CD147對口腔鱗癌細胞增殖的影響

細胞轉染后48 h,終止培養(yǎng)。用PBS沖洗1-2次,加入4%的多聚甲醛,室溫固定30 min。棄廢液,PBS洗5 min×3次。加入0.1%Triton-X100,室溫下靜置15 min。棄廢液,PBS洗5 min×3次。加入封閉液,室溫封閉30 min。棄封閉液,加入兔抗Ki67一抗(稀釋比1 ∶500),4 ℃過夜。吸出一抗,PBS洗10 min×3次。加入熒光標記的山羊抗兔二抗(稀釋比1 ∶500),室溫避光放置1 h。棄二抗,PBS洗10 min×3次。加入DAPI,室溫孵育2 min。棄廢液,PBS洗10 min×3次。加入抗熒光淬滅封片劑封片,熒光顯微鏡下觀察并拍照,使用Image-J軟件檢測并統(tǒng)計分析光密度值。

1.10 real-time qPCR檢測CD147基因的表達

表1 目的基因引物序列

1.11 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析進行統(tǒng)計學分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CD147在人OSCC組織中的表達

免疫組化結果顯示,在OSCC組織和癌旁組織中均能檢測到CD147的表達,但OSCC組織中CD147的陽性細胞數(shù)高于癌旁組織(見圖1)。經(jīng)統(tǒng)計分析,其平均光密度值分別是0.43±0.06和0.12±0.06,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。Western blot實驗結果顯示,CD147蛋白在OSCC組織的表達高于癌旁組織(P<0.05,見圖2),其表達量分別為1.27±0.15及0.60±0.15。real-time PCR結果顯示,癌旁組織和OSCC組織CD147基因的相對表達量分別為1.00±0.08及10.38±1.21,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖2)。以上結果表明無論在蛋白水平還是基因水平,CD147在人口腔鱗癌中表達均呈增高趨勢。

圖1 免疫組化檢測CD147在人口腔鱗癌中的表達情況

與癌旁組織比較,*P<0.05

2.2 real-time PCR驗證CD147-siRNA轉染情況

CD147-siRNA轉染24 h后,real-time PCR驗證轉染效率,結果顯示CD147-siRNA組中CD147轉染效率為60%,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖3)。

與NC組比較,*P<0.05

2.3 CD147對口腔鱗癌細胞增殖的影響

CCK-8結果顯示,干擾CD147表達后,UM-SCC6細胞的增殖能力受到抑制(P<0.05,見圖4A);集落形成實驗結果顯示,UM-SCC6細胞的集落形成數(shù)在干擾CD147的表達后呈減少趨勢(見圖4B)。Ki67實驗結果顯示,干擾CD147表達后,UM-SCC6細胞內Ki67的表達量減少(見圖5);平均光密度值在CD147-siRNA組及NC組中分別為165.00±19.47及331.33±30.09,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖5)。

圖4 CD147對人口腔鱗狀癌細胞UM-SCC6增殖的影響

圖5 Ki67實驗檢測CD147對人口腔鱗癌細胞增殖的影響

3 討論

口腔鱗癌是一種具有侵襲性的惡性腫瘤,它是由具有干細胞樣特征的再生癌細胞的一個獨特亞群驅動形成的[12,13]。而這些多能的癌癥干細胞樣細胞能夠通過不斷的自我更新和分化來重建原發(fā)腫瘤的異質性[14,15]。它們除了在原發(fā)性腫瘤生長和維持中起到關鍵作用外,癌癥干細胞樣細胞還具有很強的逃避放療和常規(guī)化療的能力,繼而導致局部或遠處復發(fā)[16]。腫瘤細胞的侵襲及轉移擴散是口腔鱗癌患者主要的致死原因,其主要擴散途徑為頸淋巴轉移,而是否存在淋巴轉移也是決定患者能否長期生存的關鍵。隨著分子生物學的發(fā)展,多種分子抑制劑已開始應用于腫瘤的特異性治療,這種特異性治療可以減少放化療的副作用[17,18],有利于抑制腫瘤的轉移。

細胞外基質金屬蛋白酶誘導因子CD147是一種細胞表面糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族。研究表明CD147在多類細胞中均有表達,如造血細胞、上皮細胞、內皮細胞和白細胞等。實際上CD147也參與調節(jié)人類正常代謝及疾病,尤其是癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[19],例如調節(jié)細胞增殖、凋亡以及腫瘤細胞遷移、轉移和分化等。研究表明,CD147是以通過刺激基質金屬蛋白酶和細胞因子的分泌等方式參與癌癥發(fā)生發(fā)展的調節(jié)[20,21]。亦有研究表明,CD147是肝癌的有效治療靶點,并已在肝癌的臨床治療中取得了一定進展[22]。那么CD147在口腔鱗癌中是否存在差異表達,是否對腫瘤的增殖有影響,其能否成為監(jiān)測口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展和治療的作用靶點,從而為完善口腔鱗癌患者治療方案提供新的方向是值得探討的。

本研究采用免疫組織化學及Western blot的方法對口腔鱗癌患者腫瘤組織及癌旁組織CD147蛋白進行分析發(fā)現(xiàn)CD147在口腔鱗癌中的表達高于癌旁組織。熒光定量PCR檢測結果顯示,CD147 mRNA在OSCC組織中的表達高于癌旁組織。上述結果表明CD147在OSCC中的蛋白水平及基因水平都高于癌旁組織,提示CD147或可成為OSCC的一個檢測指標。

由于OSCC的一個重要特點為增殖能力強,為了進一步檢測CD147在OSCC中的作用,本研究通過干擾CD147,繼而檢測其對口腔鱗癌細胞UM-SCC6增殖作用的影響。CCK-8實驗、集落形成實驗及Ki67三種檢測細胞增殖能力的實驗結果均表明干擾CD147可以降低UM-SCC6細胞的增殖能力,說明CD147具有調節(jié)口腔鱗癌細胞增殖的能力。有關CD147在其他類型癌癥中作用的研究表明,CD147的下調可以抑制人惡性黑色素瘤細胞系的增殖[23];過表達CD147 cDNA轉染入人類MDA-MB436乳腺癌細胞可以導致腫瘤生長增強和轉移性增加從而增加患者的發(fā)病率,其原因可能是CD147可以提高基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9的表達造成的[24]。也有報道指出通過RNAi沉默CD147可以抑制人胃癌的增殖和侵襲,并且可以增加其對抗腫瘤藥物順鉑的化學敏感性[25]。可見CD147可以促進諸多腫瘤細胞的增殖,口腔鱗狀細胞癌中亦有此特征,提示CD147或可為OSCC的治療靶點,可為OSCC的綜合治療方案提供新的方向。

本研究初步驗證了CD147在口腔鱗狀細胞癌中呈高表達狀態(tài),并可促進癌細胞的增殖。然而CD147所參與的對腫瘤發(fā)生發(fā)展的調節(jié)往往是一個多因子共同作用的復雜過程。在這個復雜的調節(jié)網(wǎng)絡中,CD147的具體作用機制以及參與方式如何均需要進一步的研究和探討。