帕金森病患者腸道菌群變化及其與臨床特征的相關性

孫百花,李年應,王 濤,吳 瓊,喬 晉*

(1西安市第三醫(yī)院神經內科,西安 710018;2西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經內科;3陜西省森林工業(yè)職工醫(yī)院神經內科;4西安交通大學第一附屬醫(yī)院康復醫(yī)學科;*通訊作者,E-mail:qiaojn123@163.com)

帕金森病(Parkinson disease,PD)是一種中老年人常見的慢性神經系統變性疾病，病理特征為黑質多巴胺能神經元大量變性、脫失，神經元α-突觸核蛋白(alpha synuclein,ɑ-SYN)沉積及路易小體(Lewy body,LB)形成[1]。中樞神經系統(central nervous system, CNS)與胃腸道的腸神經系統(enteric nervous system,ENS)和自主神經系統(autonomic nervous system,ANS)之間存在雙向交流，近年來,研究發(fā)現腦-腸軸的相互作用受腸道菌群的調節(jié),腸道微生物通過神經內分泌、免疫、直接神經機制影響大腦功能活動,并與PD患者運動癥狀及非運動癥狀有關[2]。有學者提出PD腸道起源學說,認為PD開始于腸道神經元,并逐漸進展到CNS,進而造成黑質紋狀體多巴胺能神經元損傷,出現一系列運動及非運動癥狀[2,3]。國外很多研究[4-6]已證實PD患者腸道菌群組成與正常健康人群相比發(fā)生變化,且代謝功能影響腸道及CNS活動。但國內對此方面研究較少,中國南方地區(qū)(廣東)對腸道菌群與PD方面有相關研究[7]。本研究旨在探索陜西地區(qū)PD患者腸道菌群變化與臨床表現之間的關系,希望能夠為PD病理生理機制提供科學依據,對于PD治療提供新的思路。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象

根據入選、排除標準,連續(xù)收集2018年3月至2018年11月西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經內科門診及住院部就診的30例帕金森病患者糞便標本,并選取同期就診于西安交通大學第一附屬的健康體檢者或患者家屬22例作為對照組,對照組按年齡(±5歲)、性別及飲食習慣與病例組匹配。所有研究對象均取得知情同意。

1.1.1 病例組 納入標準:所有患者均符合2015年MDS臨床確診的或很可能的帕金森病診斷標準[8]。

排除標準:①排除繼發(fā)性帕金森綜合征,如外傷后、藥物性、腦炎后、血管性等;②排除帕金森疊加綜合征,如多系統萎縮、紋狀體黑質變性、進行性核上性麻痹及額顳葉癡呆等;③排除因精神障礙、重度認知功能障礙等原因不能完成量表評定的患者;④排除合并急慢性胃腸道疾病或近1月服用激素、免疫抑制劑、抗生素及菌群調節(jié)劑者。

1.1.2 對照組 收集2018年3月至2018年11月期間在西安交通大學第一附屬醫(yī)院就診的健康體檢者或患者家屬,所有對照組人群與病例組根據年齡(±5歲)、性別、飲食習慣相互配對。

1.2 臨床表現分型方法

采用統一的帕金森病評定量表(unified Parkinson’s disease rating scale,UPDRS)Ⅲ部分對運動癥狀進行評分;依據改良的Hoehn-Yahr(H-Y)分級標準進行臨床癥狀嚴重程度分期;采用非運動評價量表(non-motor symptom related scales,NMSS)評估非運動癥狀的程度及頻率;帕金森患者生活質量問卷-39(PDQ-39)評定生活質量;按照有無便秘將患者分為便秘組及非便秘組,按照羅馬Ⅲ功能性便秘的診斷標準評價便秘,Wexner評分評價便秘嚴重程度。

根據發(fā)病年齡分為早發(fā)組(≤50歲)及晚發(fā)組(>50歲)[9]。根據改良Hoehn-Yahr(H-Y)分期分為輕度組(1-1.5期)、中度組(2-2.5期)、重度組(3-4期)[10]。根據UPDRS評分量表第2部分第16項及第3部分第20,21項的平均分定義為震顫得分;UPDRS第2部分第5,7,12-15項及第3部分18-19,22-31項的平均分為非震顫得分。根據震顫得分/非震顫得分是否大于1,將運動癥狀分為2種亞型:震顫為主型(震顫得分/非震顫得分>1)和非震顫為主型(強直少動型,震顫得分/非震顫得分≤1)[11]。

1.3 糞便標本留取步驟

①選擇一個干凈的蹲廁或馬桶,沖洗干凈,排便前先排盡尿液,然后在便池內墊兩層干凈的衛(wèi)生紙;②將糞便排在鋪好的干凈紙巾上;③打開包裝,帶上一次性手套,取出采樣保護裝置(Loogsee糞便微生物基因組保護液套裝),旋開采集管,采集糞便團塊中心約1粒黃豆粒大小的糞便,將取好的糞便采樣桿插回管內,旋緊密封旋蓋;④手握采集管,在靠近易折桿側用拇指推壓盛液管中部,使盛液管中的桿子沿根部折斷,露出小孔,輕擠盛液管使保護液通過小孔流入裝有糞便的管內;⑤將盛液管中的液體全部擠入下端管中,輕輕晃動采集管,讓采樣頭凹槽中的大便樣本與采樣頭分離并與保護液充分混勻,使管內液體呈懸濁狀;⑥將樣本保存于-80 ℃冰箱中。

1.4 DNA提取及質檢及測序

1.5 數據處理

根據原始序列(FASTQ格式)的barcodes信息(樣本唯一),運用QIIME2 demux插件對不同樣本的序列進行拆分[12]。將拆分后的序列,運用QIIME2 dada2插件進行質控,修剪(參數為-p-trunc-len-f 290,-p-trunc-len-r 256,-p-trim-left-f 26,-p-trim-left-r 26),去噪,拼接,以及去除嵌合體后,得到了最終的sOTU(sub-operational-taxonomic-unit)[13]。接著,運用QIIME2 feature-classifier插件將sOTU的代表序列比對到預先訓練好的13-8版本99%相似度的GREENGENES數據庫(根據338F/806R引物對將數據庫修剪到V3V4的區(qū)域),得到了物種的分類信息表[14]。之后用QIIME2 feature-table插件剔除了所有污染性的線粒體和葉綠體序列。接著用QIIME2 core-diversity插件計算多樣性矩陣,用emperor插件進行可視化[15]。最后,ANCOM, ANOVA, Kruskal Wallis, LEfSe和DEseq2的方法被用來鑒定分組和樣本間豐度有差異的細菌[16]。

選取2017年8月～2018年8月在我院治療的神經內科患者180例作為研究對象，將其隨機分為對照組與觀察組，各90例。其中，觀察組男52例，女38例，年齡45～78歲，平均年齡（63.47±5.25）歲，腦出血8例.腦梗死65例，肌萎縮側索硬化17例；對照組男50例，女40例，年齡45～79歲，平均年齡（63.52±5.16）歲，腦出血7例、腦梗死62例、肌萎縮側索硬化21例。兩組患者一般資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。所有患者及其家屬均知曉本次實驗的研究目的、方法和意義，自愿配合，且經我院倫理委員會批準同意。

1.6 統計方法

菌群分析,不同分組間菌群相對豐度差異檢驗使用LEfSe檢驗(非參數檢驗和線性判別分析的結合),線性判別分析log10LDA>2認為差異有統計學意義,P<0.05。α多樣性由observed-otu,shannon,faith’s phylogenetic diversity(faith-pd)及chao1等指數來評估,各個指數之間的比較采用Wilcox分析方法,P<0.05認為差異有統計學意義。臨床表型數據與微生物之間相關性采用Spearman相關分析,P<0.05認為差異有統計學意義。

2 研究結果

2.1 一般資料

PD共30例,男20例,女10例,年齡(62.93±7.88)歲,體質量指數BMI(23.51±2.53)kg/m2;健康對照組22人,男14人,女8人,年齡(62.59±7.90)歲;BMI(23.43±3.18)kg/m2,兩組間年齡、性別和BMI差異沒有統計學意義(P>0.05)。

PD患者發(fā)病年齡(58.97±9.09)歲,病程(3.89±3.09)年,震顫型12例,非震顫型18例,H-Y分級1.75(1.5,2.0),UPDRS Ⅲ評分(16.27±8.16)分,左旋多巴劑量平均(440.48±215.13)mg/d,其中使用左旋多巴制劑21例,多巴胺受體激動劑13例,MAO-B抑制劑10例,金剛烷胺6例。伴發(fā)運動波動8例,異動癥3例;伴發(fā)便秘患者15例;早發(fā)型8例,晚發(fā)型22例。

2.2 PD患者腸道菌群分布特點

2.2.1 測序數據 兩組52個樣本共2 455 309條可用序列,序列平均長度407 bp,對所有樣品全部的有效序列進行聚類/去噪,獲得2 634個可操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)。選取OTU的代表性序列與核糖體RNA數據庫(GREENGENES Database 13-8版本,按99%序列相似性聚類)進行比對獲得物種注釋信息。基于OTU的絕對豐度及注釋信息,對每個樣品在一共7個分類水平種、屬、科、目、綱、門、界(Species,Genus, Family, Order, Class, Phylum,Kingdom)上的序列數目占總序列數的比例進行統計。

2.2.2 菌群多樣性分析 對某個樣品中物種多樣性的分析主要采用α多樣性分析,用observed-otus,chao1,shannon以及faith’s phylogenetic diversity(faith-pd)指數來評估樣本的物種多樣性。本研究發(fā)現PD患者相較于正常對照在faith-pd指數、chao1指數、observed-otus指數、shannon指數方面均增高,差異有統計學意義(P=0.001 4,0.001 8,0.001 9,0.001 8)。結果顯示,與對照(control)組相比較,PD組在菌群豐度及多樣性方面均增高(見圖1)。

圖1 PD組與對照組α多樣性比較

表1 PD組與對照組在門水平細菌豐度比較

在科水平,雙歧桿菌科(Bifidobacteriaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、腸桿菌科(Enterobacteriaceae)、鏈球菌科(Streptococcaceae)、草酸桿菌科(Oxalobacteraceae)、醋酸桿菌科(Acetobacteraceae)、紅椿菌科(Coriobacteriaceae)、克里斯滕森菌科(Christensenellaceae)、組織菌科(Tissierellaceae)、紅螺菌科(Rhodospirillaceae)、叢毛單胞菌科(Co-mamonadaceae)和紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)的豐度PD組明顯高于對照組(LEfSe檢驗,均P<0.05)。韋榮球菌科(Veillonellaceae)的豐度PD組明顯減低(LEfSe檢驗,P=0.031,見圖2)。

圖2 PD組與對照組在科水平菌群豐度比較

在屬水平,PD組卟啉菌屬(Porphyromonas)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、乳酸菌屬(Lactococcus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、顫螺菌屬(Oscillospira)、草酸桿菌(Oxalobacter),毛螺菌屬(Lachnospira)、腸球菌屬(Enterococcus)、脫硫弧菌(Desulfovibrio)、吉米菌屬(Gemmiger)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)、丁酸弧菌屬(Butyricimonas)、另枝菌屬(Alistipes)和熒光桿菌屬(Odoribacter)的豐度明顯增高,而PD組光崗菌屬(Mitsuokella)豐度顯著減低(LEfSe檢驗,均P<0.05,見圖3)。

圖3 PD組與對照組在屬水平菌群豐度比較

2.2.4 腸道菌群與PD臨床表現 按照不同分類方法,對PD患者進行臨床分型,分別分析不同臨床表現中腸道菌群組成差異。結果發(fā)現,伴發(fā)便秘患者(15人)與非便秘患者(15人)、震顫型(12人)與非震顫型(18人)、早發(fā)型(8人)與晚發(fā)型(22人)、伴發(fā)運動并發(fā)癥(11人)與不伴發(fā)運動并發(fā)癥(19人)、男性(20人)與女性(10人)、經藥物治療(24人)與未經藥物治療(6人),不同臨床分型菌群α多樣性指數observed-otus、chao 1、shannon以及faith-pd均未見明顯差異(Wilcox檢驗,均P>0.05)。

2.2.5 腸道菌群與臨床特征相關關系 在門水平,厚壁菌門及放線菌門豐度與UPDRS Ⅲ評分、NMSS評分、Wexner評分、PDQ-39評分均呈正相關;擬桿菌門豐度與UPDRS Ⅲ評分、NMSS評分、Wexner評分、PDQ-39評分均呈負相關,與臨床分型、病程、H-Y分級、左旋多巴等效劑量等無明顯相關性(見表2)。

表2 門水平菌群豐度與臨床特征相關關系

在科水平,雙歧桿菌科、腸桿菌科及紫單胞菌科豐度與UPDRS Ⅲ評分、NMSS評分、PDQ-39評分均呈正相關正相關(P<0.05,見表3)。

表3 科水平菌群豐度與臨床特征相關關系

3 討論

根據Braak病理分期,PD病變部位最早可能起始于嗅球及腸道肌間神經叢。近年來研究發(fā)現PD的病理改變可能是通過腸道菌群波及腸道神經系統。腸道菌群的改變導致α-突觸核蛋白(alpha synuclein,α-SYN)的錯誤折疊,這些病理性α-SYN通過肌間神經叢被腸黏膜吸收進入腸道神經叢,然后沿迷走神經逆行傳入腦干及大腦,造成黑質多巴胺能神經元損傷[17]。另外,腸道菌群通過產生與宿主神經系統相互作用的激素和神經遞質,如單胺類、γ-GABA、短鏈脂肪酸等,對宿主神經活動產生直接影響,造成中樞神經系統膠質細胞活化、促炎信號分子產生和氧化應激等反應,這可能是導致PD神經退行性變的重要機制[18]。

既往研究報道了腸道菌群與PD關系。Ali等[19]的研究發(fā)現,PD患者中擬桿菌門、變形菌門及疣微菌門豐度明顯增高,而厚壁菌門豐度明顯減低,在屬水平,Akkermansia(疣微菌門,疣微菌綱)、顫螺菌屬(厚壁菌門,梭狀芽胞桿菌綱)、擬桿菌屬(擬桿菌門,擬桿菌綱)豐度明顯增高。在我們的研究中,發(fā)現部分門水平菌群變化與他們的研究結果相似,我們發(fā)現變形菌門相對豐度明顯增高,厚壁菌門、放線菌門豐度增高,而擬桿菌門豐度明顯減低,這與我國李悅等[20]的研究結果相似。在屬水平,顫螺菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬豐度明顯增加。Hasegawa等[21]的研究發(fā)現PD患者乳酸菌明顯增高,且腸道菌群與左旋多巴及其他抗帕金森病藥物均未發(fā)現明顯相關性。乳酸菌豐度增高可造成腸道激素ghrelin水平減低,ghrelin可調節(jié)黑質紋狀體多巴胺水平,亦可抑制PD神經元變性。在PD患者中,可觀察到ghrelin分泌受損[22]。乳酸菌亦可調節(jié)腸道神經元和迷走神經傳入活動,從而影響細胞內α-SYN的分泌。Scheperjans等[6]的研究發(fā)現,PD患者普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)豐度減少了77.6%。Gabrielli等[23]的研究發(fā)現,PD患者更易伴發(fā)小腸細菌過度增殖癥,PD伴發(fā)小腸細菌過度增殖癥患者非運動癥狀發(fā)生率增高,且普雷沃氏菌豐度減低。普雷沃氏菌是結腸的共生菌,不僅降低腸道黏膜層的植物多糖、黏蛋白及糖蛋白,也與免疫系統相互作用,它與短鏈脂肪酸的水平相關,也與硫胺素及葉酸的生物合成相關。普雷沃氏菌減少導致腸道黏蛋白合成減少,黏膜通透性增高,局部或系統暴露于細菌毒素,導致結腸α-SYN表達增加[24]。但在我們的研究中發(fā)現,PD患者中普雷沃氏菌科豐度減低,但差異無統計學意義。在中國南方Lin等[7]的研究中發(fā)現,厚壁菌門豐度明顯減低,而擬桿菌門及疣微菌門豐度增加,但差異無統計學意義;在科水平,發(fā)現毛螺旋菌科豐度減低,韋榮球菌科、疣微菌科豐度增高。在趙程等[25]的研究中,擬桿菌門明顯減低,而放線菌門豐度明顯增高;在科水平,鏈球菌科及腸桿菌科在PD患者糞便中明顯增高。而在我們的研究中發(fā)現,相較于正常對照組,PD組患者腸道菌群組成中毛螺旋菌科、腸桿菌科、鏈球菌科、雙歧桿菌科、瘤胃菌科、草酸桿菌科、醋酸桿菌科等豐度明顯增高,而韋榮球菌科豐度減低。我們的研究結果與國內研究結果部分一致。

正常人體內腸道微生物中占主導地位的是厚壁菌門和擬桿菌門,其次是放線菌門、變形菌門[26]。腸道菌群組成與不同地區(qū)飲食習慣差別有密切關系,在我們的研究中,患者大部分來源于陜西地區(qū),主食以面食為主者居多,且面食以小麥面為主,少部分患者主食以大米為主。有研究表明,食用全谷物為主的人相較于食用小麥及大米為主的人,腸道中雙歧桿菌的水平明顯增加,雙歧桿菌屬于放線菌門[27],而我們的研究結果中雙歧桿菌科豐度增高,這與飲食習慣導致菌群改變并不一致,因此我們結果中菌群改變并不是因飲食影響,而是由于疾病本身因素導致。另有研究表明,食魚肉等肉類為主的小鼠體內擬桿菌門明顯增加而厚壁菌門數量明顯減低[27],中國南方飲食習慣以魚肉、海鮮類、稻米等居多,這可能是他們的研究結果與我們不同的一個原因。“高碳水化合物、高脂”為西方常見的飲食模式,以高糖高脂飲食為主的小鼠體內擬桿菌門明顯減少,而厚壁菌門的數量增加[27,28]。這與西方研究結果也不相符,所以,PD腸道菌群的組成及豐度的變化為疾病本身改變,非飲食習慣所致。

既往研究發(fā)現,普雷沃氏菌與UPDRS Ⅲ評分相關,臨床表型以姿勢步態(tài)異常為主的PD患者腸桿菌科的數量明顯多于震顫型患者,且腸桿菌科豐度與抗帕金森藥物COMT抑制劑有關[6]。Unger等[5]的研究中發(fā)現,雙歧桿菌屬及腸桿菌科在PD患者豐度增高,但腸桿菌科與臨床表型亦未發(fā)現明顯相關性。但在我們的研究中,相關性分析發(fā)現,在門水平,厚壁菌門、放線菌門,在科水平,腸桿菌科、雙歧桿菌科、紫單胞菌科豐度與UPDRS Ⅲ、NMSS、PDQ-39評分呈正相關,但與臨床表型、病程、病情嚴重程度等未發(fā)現明顯相關性。并且在我們的研究中,服用COMT抑制劑患者只有2例,遂未分析菌群與藥物關系,未服用抗帕金森藥物的患者僅有6例,研究未發(fā)現菌群組成與左旋多巴之間的關系。有研究表明,早發(fā)型患者中梭桿菌門明顯增高,健康人群中,梭桿菌門含量極少,梭桿菌與腸道黏膜屏障改變及細胞代謝有明顯關聯。我們的研究中未發(fā)現早發(fā)型及晚發(fā)型PD患者腸道菌群α及β多樣性之間差異。有研究表明,PD的嚴重程度和病程與腸道菌群具有明顯相關性,毛螺旋菌科與PD病程呈負相關性,此菌科包含多種產丁酸菌,產丁酸菌的豐度減低,可引起丁酸鹽(短鏈脂肪酸中一種)含量減低,短鏈脂肪酸可引起腸道通透性增加,促進腸道炎癥反應[24]。對PD患者及正常人糞便中短鏈脂肪酸水平進行定量研究,發(fā)現PD患者糞便樣品中乙酸、丙酸和丁酸的絕對濃度顯著下降,丁酸鹽的濃度相對減少,且應用恩他卡朋與丁酸濃度呈負相關[5]。Forsyth等[24]報告PD患者糞便中大腸桿菌(腸桿菌科中一種)含量增加,大腸桿菌可導致腸道屏障功能受損,腸黏膜通透性增加,使腸道神經系統更容易與病原接觸。我們的研究雖沒有發(fā)現PD患者中大腸桿菌水平增高,但發(fā)現腸桿菌科水平增高。在我們的研究中,可能由于研究樣本數量較少,某些菌群變化與既往研究不相符,且在不同臨床表現分型與腸道菌群組成單因素分析中,不同臨床表現的分型數量少,未發(fā)現明顯有意義的菌群差異,在相關性研究中雖發(fā)現某些菌群與UPDRS Ⅲ評分、NMSS評分及Wexner評分等相關,但相關系數低,需要擴大樣本量進一步研究。

糞便菌群移植(fecal microbiota transplantation,FMT)作為一種新型的改善腸道微生物群態(tài)的手段。通過收集正常健康人群糞便,通過灌腸、結腸鏡等方法移植于患者低位或高位腸道內,重建患者腸道菌群,從而治療各種胃腸道疾病及胃腸外疾病。目前已有在臨床中關于糞便菌群移植應用于頑固型便秘、炎癥性腸病、腸易激綜合征、肥胖等疾病治療成功的案例。隨著對“腦—腸—微生物軸”認識的進展,糞便移植應用于PD、多發(fā)性硬化、阿爾茨海默病等神經退行性疾病仍在進行探索[29]。但因糞便移植健康標本等的篩選、制備及移植方式等尚未有統一結論,且循證依據不足,限制了糞便移植在臨床中的應用。未來可能需要更多的研究支持這方面結論,為PD治療提供一種新的思路。