基于16S rDNA分析大承氣湯對過敏性哮喘小鼠腸道菌群的影響

王永安，李亞蘭，吳佳佳，葛東宇，彭桂英

基于16S rDNA分析大承氣湯對過敏性哮喘小鼠腸道菌群的影響

王永安1，李亞蘭1，吳佳佳1，葛東宇2，彭桂英1

1.北京中醫藥大學生命科學學院，北京 100029；2.北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029

通過16S rDNA測序探討大承氣湯對過敏性哮喘小鼠腸道菌群的影響。SPF級C57BL/6 雌性小鼠，隨機分為對照組、模型組、大承氣湯組和地塞米松組。采用卵清蛋白-氫氧化鋁法制備過敏性哮喘小鼠模型，成模后進行肺組織病理切片PAS染色，取糞便提取DNA進行高通量16S rDNA測序分析及菌群選擇性培養、菌落計數。與對照組比較，模型組小鼠肺指數明顯升高（＜0.001），肺泡結構消失，支氣管及血管周圍大量炎性細胞浸潤，氣管內大量黏蛋白分泌；與模型組比較，大承氣湯組小鼠肺指數明顯下降，肺泡結構較清晰，炎性細胞浸潤明顯減少，氣管內黏蛋白分泌量明顯減少。腸道菌群物種組成分析顯示，模型組小鼠乳桿菌屬和螺桿菌屬含量下降，大承氣湯組含量增加；模型組小鼠擬普雷沃菌屬含量增加，大承氣湯組含量下降。模型組小鼠腸道菌群結構與對照組明顯不同，大承氣湯組菌群結構恢復；腸道菌群選擇性培養結果顯示，模型組小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌數量顯著增加（＜0.001，＜0.01），大承氣湯組顯著減少（＜0.01，＜0.05）；模型組小鼠腸道乳酸桿菌數量顯著減少（＜0.01），大承氣湯組明顯增加（＜0.01）。大承氣湯可降低哮喘小鼠腸道大腸桿菌和腸球菌含量、提高乳酸桿菌含量，恢復腸道菌群結構。

過敏性哮喘；大承氣湯；腸道菌群；16S rDNA測序；小鼠

過敏性哮喘是由氣道上皮細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等多種細胞和細胞組分參與的，以氣道慢性炎癥為特征的異質性疾病，臨床表現為喘息、氣促、胸悶及咳嗽等多變的呼吸道癥狀伴可逆的呼氣氣流受限，屬中醫學“哮證”“喘證”范疇。西醫治療以糖皮質激素為主，但不良反應較多，如口腔念珠菌病、聲音嘶啞、咽炎等[1]。近年來許多哮喘與腸道菌群相關研究顯示，腸道與呼吸道在生理與病理上關系密切[2-3]。研究表明，成年人中過敏性哮喘患者糞便菌群整體組成與健康個體不同[4]。中醫治療過敏性哮喘具有獨特優勢。大承氣湯出自《傷寒雜病論》，是從腸治肺的代表方。我們前期研究發現，大承氣湯可改善哮喘小鼠肺組織炎癥，抑制MAPK信號通路激活[5-6]，但其機制是否與作用于腸道菌群、改變菌群群落組成有關，迄今尚未明確。因此，本研究從分析腸道菌群出發，進一步探討大承氣湯對哮喘小鼠療效的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

雌性C57BL/6小鼠24只，SPF級，6～8周，體質量18 g以上，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0002。飼養于溫度20～26 ℃、相對濕度40%～70%環境，最大溫差不超過4 ℃，噪音小于60 db，每小時保持通風換氣數次，光照12 h/12 h明暗交替。

1.2 藥物及制備

大承氣湯（大黃12 g，枳實12 g，厚樸24 g，芒硝9 g，此為臨床成人藥量），飲片購自北京同仁堂總店，由北京中醫藥大學中藥學院王秀麗副教授鑒定為正品。藥物浸泡30 min，先武火煎煮10 min，再文火煎煮20 min，煎煮2次，合并煎液，水煎濃縮至含原藥材1.9 g/mL，將所得藥液用雙層紗布過濾，置于4 ℃冰箱貯存備用。小鼠給藥量按體表面積換算，給予臨床等效劑量。地塞米松片，天津力生制藥股份有限公司，批號1705016；將地塞米松片研成粉末溶于生理鹽水，每日藥量為5 mg/kg。

1.3 主要試劑與儀器

卵清蛋白（OVA，美國Sigma-Aldrich公司，貨號41235），10×PBS（美國Invitrogen公司，貨號1627690），氫氧化鋁凝膠（40 mg/mL，50 mL，德國Thermo公司，貨號77161）。PAS染色試劑盒（美國Solarbio公司，貨號G1340）。TPY培養基、MRSA培養基（北京陸橋技術有限責任公司），KV培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司），EMB培養基（北京奧博星生物技術有限責任公司），BEA培養基（北京陸橋技術有限責任公司）。醫用霧化器（PARI Turbo BOY N），天平（ACS-3C型，廣州中山市新和基科技開發有限公司），電熱恒溫鼓風干燥箱（DCG-9140B型，上海森信實驗儀器有限公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），5415型高速離心機（德國Eppendorf公司），2.5 L三菱MGC圓底立式培養袋、三菱MGC厭氧產氣袋、37 ℃普通培養箱、Ⅱ級生物安全柜（日本三菱公司），HM325型石蠟切片機（德國Microm公司）。

1.4 分組、造模及給藥

動物適應性飼養1周，按隨機數字表法將小鼠分為對照組、模型組、大承氣湯組和地塞米松組，每組6只。采用OVA誘導制備過敏性哮喘小鼠模型[7]。全程分為2個階段。①2次致敏：分別于第0、14日，模型組和給藥組每只小鼠腹腔注射0.2 mL抗原液（每0.2 mL含2 mg 氫氧化鋁、20 μg OVA），對照組小鼠給予等量生理鹽水處理。②霧化激發：自造模第21日開始，將小鼠置于霧化箱中，模型組和給藥組小鼠霧化吸入1%OVA激發，對照組小鼠給予生理鹽水霧化，1次/d，30 min/次，連續7 d。從第21日起，霧化前1 h，大承氣湯和地塞米松組分別給予大承氣湯和地塞米松灌胃，每只0.2 mL，對照組和模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.5 檢測指標

1.5.1 肺指數

稱重后脫頸處死小鼠，打開胸腔取出肺臟，摘除氣管、肺門淋巴結等組織，吸干肺臟表面血液，稱取肺臟質量。計算肺指數。肺指數（%）＝肺質量÷體質量×100%。

1.5.2 肺組織形態

取肺組織，10%甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，組織切片（厚約5 μm，每個標本連續切3張），PAS染色，中性樹膠封片后，鏡下觀察肺組織形態。

1.5.3 腸道菌群16S rDNA測序分析

收集對照組、模型組、大承氣湯組小鼠糞便樣本，-80 ℃冰箱保存。樣品16S rDNA檢測由北京奧維森基因科技有限公司完成，選取細菌16S rDNA的V3～V4區進行基因擴增與測序。引物序列：338F，5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；806R，5’-GGA CTACHVGGGTWTCTAAT-3’。擴增反應體系：FastPfu Buffer（5×）4 μL、dNTPs（2.5 mmol/L）2 μL、Forward Primer與Reverse Primer各0.8 μL、DNA模板10 ng、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL，最后加ddH2O至20 μL。擴增反應條件：95 ℃，3 min；（95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s）×30；72 ℃，10 min。每個樣本5個重復，將同一樣本PCR產物混合，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST定量系統進行檢測定量，之后按照每個樣本測序量要求，進行相應比例的混合。構建Illumina平臺文庫，進行Illumina測序。按指定測序區域，合成帶有barcode的特異引物。分析前先對原始數據進行過濾處理，再進行序列拼接，得到優化序列。再去除嵌合體序列后進行OTU聚類分析，對OTU代表序列作分類學分析?；贠TU聚類分析結果，對OTU進行多種多樣性指數分析及測序深度檢測；基于分類學信息，在各分類水平上進行群落結構統計分析。在上述分析基礎上，進行群落結構和系統發育的統計學和可視化分析。

1.5.4 平板菌落計數

利用選擇鑒別培養基，采用平板活菌計數法對腸道主要固有菌群進行定性、定量分析。根據培養基說明書配制培養基，高壓滅菌后倒入無菌培養皿中，冷卻后放置4 ℃留用。取0.1 g近結腸端糞便，加入1 mL無菌生理鹽水，混合均勻，按10-1、10-2、10-3……10-9進行樣本稀釋，將樣本稀釋液分別滴在培養基上，再用涂布棒涂布均勻，每個稀釋度接種3塊培養基，計數時取菌落平均數。EMB、BEA培養基置37 ℃孵育24 h，TPY、MRSA、KV培養基放入培養袋，將厭氧產氣袋投入培養袋，封閉，37 ℃孵育48 h。觀察菌落特征，計算活菌數，革蘭氏染色初步鑒定目的菌群。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 大承氣湯對哮喘小鼠肺指數的影響

與對照組比較，模型組小鼠肺指數明顯增加，差異有統計學意義（＜0.001）；與模型組比較，大承氣湯組和地塞米松組小鼠肺指數均明顯下降，差異有統計學意義（＜0.05，＜0.01）。結果見表1。

表1 各組小鼠肺指數比較（±s，%）

注：與對照組比較，***＜0.001；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.2 PAS染色結果

對照組小鼠肺泡壁結構完整，肺泡隔厚度正常，黏膜下及氣管周圍未見炎性細胞浸潤；模型組小鼠肺泡結構不清晰，支氣管及血管周圍大量炎細胞浸潤，管腔內有大量分泌物，可見黏液栓，支氣管壁略顯增厚；大承氣湯組和地塞米松組小鼠肺泡結構較清晰，炎性細胞浸潤明顯減少，氣管內黏液分泌量明顯下降。見圖1。

注：紅色箭頭所指為氣道中分泌黏蛋白

2.3 16S rDNA測序結果

造模后收集小鼠糞便，每組隨機選擇5只小鼠，提取總DNA進行16S rDNA測序分析。得到各樣本平均reads數目為39 167個，OTUs數目為531個。3組共有OTUs數為373個，對照組、模型組和大承氣湯組獨有OTUs數分別為20、11、42個；對照組與模型組共有OTUs數為24個，對照組與大承氣湯組共有OTUs數為33個，模型組與大承氣湯組共有OTUs數為28個。結果見圖2。

圖2 各組OTU分布韋恩圖

Chao1指數即菌種豐富度指數，用以估計群落中OTU數目。Shannon指數是用來估算樣品中微生物多樣性指數之一。與對照組比較，模型組小鼠腸道菌群Chao1指數和Shannon指數均升高，經大承氣湯治療后下降。見圖3。

圖3 各組小鼠腸道菌群alpha多樣性分析

根據分類學分析結果，可得知一個或多個樣本在各分類水平上的分類學比對情況。在屬水平上，與對照組比較，模型組小鼠乳桿菌屬和螺桿菌屬含量下降，大承氣湯組含量均增加；模型組小鼠擬普雷沃菌屬含量增加，大承氣湯組含量下降。見圖4。

圖4 各組小鼠腸道菌群屬水平物種組成分析

主成分分析（PCA）是一種對數據進行簡化分析的技術，通過分析不同樣本OTU（97%相似性）組成可反映樣本間的差異和距離，樣本組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。圖5中每個點代表一個樣品，點與點之間距離代表樣品間物種組成的相似度，圖中對照組與模型組菌群結構差異明顯，而大承氣湯組菌落結構向對照組靠近。

圖5 各組小鼠腸道菌群PCA分析

2.4 大承氣湯對哮喘小鼠腸道5種固有菌群數量的影響

與對照組比較，模型組小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌數量顯著增加（＜0.001），乳酸桿菌數量顯著減少（＜0.01）；與模型組比較，大承氣湯組小鼠腸道大腸桿菌及腸球菌數量顯著減少（＜0.01，＜0.05），乳酸桿菌數量顯著增加（＜0.01）。這與測序結果基本一致。各組雙歧桿菌、擬桿菌數量比較差異無統計學意義（＞0.05）。見表2。

表2 各組小鼠腸道固有菌群菌落數比較（±s，lgCFU/g）

注：與對照組比較，**＜0.01，***＜0.001；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

3 討論

“肺與大腸相表里”是中醫經典理論，具有豐富的內涵。研究表明，肺部與腸道除在胚胎發育及生理功能上有相近之處外，許多肺腸疾病的發生發展存在一定的聯系[8]。大承氣湯為攻下通腑之方，能促進腸道蠕動，使胃腸氣機得以通降，腑氣通暢，則肺氣得以宣發。本研究以OVA誘導的過敏性哮喘小鼠為動物模型，觀察大承氣湯對模型小鼠腸道菌群的影響。前期研究發現，大承氣湯能改善OVA誘導的哮喘小鼠肺部炎癥病理，降低血清IgE水平[6，9]。本研究發現，大承氣湯治療后哮喘小鼠肺指數下降，肺組織PAS染色顯示，大承氣湯對過敏性哮喘小鼠肺部炎癥及氣管黏蛋白過量分泌有明顯的改善作用，與上述研究結果一致。

肺部疾病在一定程度上可影響腸道病理生理狀態。Hijazi等[10]研究表明，過敏性哮喘兒童患者腸黏膜通透性明顯高于健康兒童。腸道菌群是機體消化系統微環境的重要組成部分，與許多疾病尤其是過敏性疾病發生發展關系密切。研究表明，腸道菌群可參與肺部免疫調節和機體防御[11]。Trompette等[12]發現，腸道菌群對膳食纖維的代謝能影響氣道過敏反應和穩態。本實驗結果顯示，過敏性哮喘小鼠腸道菌群菌落組成結構與對照組明顯不同，經大承氣湯治療后，腸道菌群結構有所恢復。大腸桿菌是腸道中一類機會致病性細菌。Jong等[13]發現，過敏性哮喘患者病重程度與大腸桿菌入血指數呈正相關。乳酸桿菌是常見的腸道益生菌。Wu等[14]發現，LGG（Lactobacillus rhamnosus GG）能明顯改善OVA誘導的小鼠氣道炎癥反應，同時促進氣道重構和膠原蛋白表達。本實驗結果顯示，過敏性哮喘小鼠腸道大腸桿菌數量明顯增加，乳酸桿菌數量明顯下降，經大承氣湯治療后，大腸桿菌數量明顯下降，乳酸桿菌數量明顯增加，與上述相關研究結果基本一致。

綜上所述，OVA誘導哮喘小鼠存在腸道菌群組成結構的改變，尤其大腸桿菌和腸球菌明顯增加，乳酸桿菌減少，大承氣湯可糾正哮喘小鼠腸道菌群組成結構的改變，這可能是大承氣湯發揮治療哮喘小鼠療效的作用機制。然而，大承氣湯對腸道菌群的調節作用是否為其療效作用的關鍵，尚需使用廣譜抗生素清除腸道菌群或利用無菌動物模型進一步證實。此外，腸道菌群及其代謝產物是如何影響哮喘小鼠肺部免疫功能和穩態的，均值得進一步研究。

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Effects ofDecoction on Intestinal Flora in Allergic Asthmatic Mice Based on 16S rDNA Sequencing

WANG Yong’an1, LI Yalan1, WU Jiajia1, GE Dongyu2, PENG Guiying1

To investigate the effects ofdecoction on intestinal flora in allergic asthmatic mice through 16S rDNA sequencing.SPF C57BL/6 female mice were randomly divided into control group, model group,Decoction group and dexamethasone group. The allergic asthma murine model was established by immunizing with ovalbumin and Al(OH)3mixture. At the end of the experiment, lungs were dissected for PAS staining and feces were collected for 16S rDNA sequencing as well as bacterial selective culture and microbial community count.Compared with control group, the lung index of mice in the model group significantly increased (<0.001), the alveolar structure disappeared, a large number of inflammatory cells infiltrated the bronchus and blood vessels, and a large amount of mucin was secreted in the trachea. Compared with the model group, the lung index of theDecoction group significantly decreased(<0.05), the alveolar structure was clearer, the inflammatory cell infiltration was significantly reduced, and the mucin secretion in the trachea was significantly reduced. The analysis of the species composition of the intestinal flora showed that the content ofandin the model group decreased, and the content increased inDecoction group; the content ofin the model group increased, but decreased inDecoction group. The community composition of intestinal microbiota from mice in the model group was significantly different from that of the control group, and the flora structure recovered inDecoction group; The results of selective culture of intestinal flora showed that the number of intestinalandin the model group mice increased significantly (<0.001,<0.01), and significantly decreased inDecoction group (<0.01,<0.05); the number of lactobacilli in the intestines of mice in the model group decreased significantly (<0.01), and increased significantly inDecoction group (<0.01).Decoction can reduce the content ofandin the intestinal tract of asthmatic mice, increase the content of lactobacilli, and restore the communities of the intestinal flora.

allergic asthma;Decoction; intestinal flora; 16S rDNA sequencing; mice

R285.5

A

1005-5304(2021)02-0076-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202008445

國家自然科學基金面上項目（81473656）；北京中醫藥大學基本科研業務費項目（2019-JYB-TD014）

（收稿日期：2020-08-28）

（修回日期：2020-09-16；編輯：華強）