安神定志方對阿爾茨海默病大鼠海馬組織miR-103a-3p及其介導的Tau蛋白磷酸化的影響

王欣波，趙宇，袁星星

安神定志方對阿爾茨海默病大鼠海馬組織miR-103a-3p及其介導的Tau蛋白磷酸化的影響

王欣波1，趙宇1，袁星星2

1.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150006

觀察安神定志方對阿爾茨海默病（AD）大鼠海馬組織miR-103a-3p及其介導的Tau蛋白磷酸化的影響，探討其相關作用機制。通過GEO數據庫篩選AD海馬組織差異表達miRNA。50只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、miR-103a-3p mimic組、安神定志方組和miR-103a-3p mimic＋安神定志方組，每組10只，采用Aβ1-42側腦室注射制備AD大鼠模型。造模后各給藥組給予相應藥物干預4周。Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力，HE染色觀察海馬組織形態，RT-PCR檢測海馬組織miR-103a-3p基因的表達，Western blot和免疫組化檢測海馬組織腦源性神經營養因子（BDNF）及Tau蛋白的表達。通過GEO數據庫共篩選出34個差異miRNA，其中17個上調、17個下調。與模型組比較，安神定志方顯著增加AD大鼠跨越平臺次數和有效停留時間，減少逃避潛伏期，改善海馬CA1區組織形態，上調BDNF的表達，抑制miR-103a-3p、p-TauSer396和p-TauThr231的表達，差異均有統計學意義（＜0.05）。安神定志方可能通過抑制海馬組織miR-103a-3p的表達進而促進BDNF的表達，調控Tau蛋白的磷酸化水平，從而促進AD大鼠學習記憶能力。

安神定志方；阿爾茨海默病；GEO數據庫；miR-103a-3p；Tau蛋白磷酸化；大鼠

阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）是臨床常見的神經退行性疾病，約占所有癡呆類型的60%～80%。AD以細胞外β淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積形成的老年斑及細胞內Tau蛋白過度磷酸化引起的神經元纖維纏結為主要病理特征。迄今為止，AD發病確切機制尚未被完全詮釋，導致治療存在諸多不足，臨床多以對癥治療為主。AD屬中醫學“健忘”“癡呆”范疇。安神定志方出自《醫學心悟》，具有安神定志、化痰鎮驚功效。現代藥理研究顯示，安神定志方活性成分對AD均有一定的治療作用[1-3]。課題組前期研究發現，安神定志方可通過激活BDNF/TrkB信號通路進而抑制Tau蛋白的磷酸化水平，從而改善AD大鼠學習和記憶的能力[4]。本研究通過檢測腦源性神經營養因子（BDNF）上游miR-103a-3p的表達水平，為進一步明確安神定志方的作用機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 數據來源

本研究所用芯片數據下載于GEO數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。獲得GSE129053數據集[5]，采用GPL18058平臺（Exiqon miRCURY LNA microRNA array，7th generation）。數據集以Aβ1-42誘導的AD模型和假手術大鼠海馬組織為研究樣本，每組3只，共6只。

1.2 數據處理

采用Bioconductor軟件的“limma”包對芯片數據進行缺失補全、校正和歸一化處理。使用R軟件對數據進行貝葉斯檢驗，以adj＜0.05和|LogFC|≤2為條件對差異miRNA進行篩選。

1.3 動物及分組

50只雄性SD大鼠，體質量（214±9）g，購于黑龍江中醫藥大學動物實驗中心，動物質量合格證號SCXK（黑）2015003。飼養于黑龍江中醫藥大學中西醫結合實驗室，溫度21～24 ℃，相對濕度45%～55%，自由攝食飲水，每日光照時間12 h。適應性飼養1周后隨機分為空白組、模型組、miR-103a-3p mimic組、安神定志方組和miR-103a-3p mimic＋安神定志方組，每組10只。

1.4 藥物及制備

安神定志方（黨參15 g，茯苓15 g，茯神15 g，龍齒25 g，遠志5 g，石菖蒲5 g），飲片購自黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院中藥房，加水浸泡，煎煮2次，合并藥液，過濾，濃縮至含原藥材40 mg /mL。

1.5 主要試劑與儀器

miR-103a-3p mimic，上海吉瑪制藥技術有限公司合成（A0018084），使用前將1 nmol/L的miR-103a-3p mimic溶液置于100 μL PBS，再將70 μL PBS與30 μL Lipofectamine 2000混合液（11668-026）與之混勻；Aβ1-42，美國Sigma公司，批號M2168；HE染色試劑盒，南京建成生物工程研究所，批號20190617；mirVana miRNA試劑盒，美國賽默飛世爾科技公司，貨號AM1556；BDNF、Tau、p-TauSer396、p-TauThr231和β-actin一抗兔多克隆抗體，上海碧云天生物技術有限公司，貨號分別為P0015A、P0022A、P0023A、P0013、P0025；辣根過氧化物酶（HRP），沈陽萬類生物科技有限公司，貨號wl0715。腦立體定位儀（KW-DWY-S，南京卡爾文生物科技有限公司），微量注射儀（北京品超思瑞科技有限公司），Morris水迷宮（上海軟隆科技發展有限公司），CX23光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社），164-5052蛋白電泳和轉膜儀（美國伯樂公司），ABI7500熒光定量PCR儀（美國賽默飛世爾科技公司）。

1.6 模型建立及藥物干預

采用Aβ1-42側腦室注射建立AD大鼠模型[6]。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，將其固定于腦立體定位儀，側腦室定位參照《大鼠腦立體定位圖譜》[7]。采用微量注射儀向大鼠側腦室內緩慢勻速注射濃度為1 g/L Aβ1-42溶液3 μL，空白組注射等體積生理鹽水，留針3 min，以1 mm/min速度緩慢退針，牙托粉封孔。術后第3日起大鼠給予相應藥物干預，miR-103a-3p mimic組尾靜脈注射miR-103a-3p mimic 200 μL，安神定志方組給予安神定志方濃縮液（0.2 g/kg）1 mL灌胃，miR-103a-3p mimic＋安神定志方組給予miR-103a-3p mimic 200 μL尾靜脈注射聯合安神定志方濃縮液（0.2 g/kg）1 mL灌胃，空白組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，連續4周。

1.7 指標檢測

1.7.1 Morris水迷宮實驗

第21日采用Morris水迷宮實驗檢測大鼠學習記憶能力，包括適應性訓練、定位巡航和空間探索3個部分，記錄大鼠逃避潛伏期、跨越平臺次數和有效停留時間，連續7 d。

1.7.2 HE染色

第29日大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，斷頭取腦，分離海馬CA1區，4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，切片，HE染色，鏡下觀察組織形態。

1.7.3 RT-PCR檢測

取部分海馬組織，根據試劑盒說明書使用mirVana miRNA試劑盒提取總miRNA，并用非編碼miRNA第一鏈互補DNA合成試劑盒對miRNA進行反轉錄至cDNA。引物miR-103a-3p：F 5’-ATCCAG TGCGTGTCGTG-3’，R 5’-TGCTAGCAGCATTGTAC AGG-3’，擴增產物長度92 bp；U6：F 5’-GCTTCG GCAGCACATATACTAAAAT-3’，R 5’-CGCTTCACG AATTTGCGTGTCAT-3’，擴增產物長度125 bp。Power SYBR Green PCR預混液混勻后置于ABI7500熒光定量PCR儀進行擴增反應，以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miR-103a-3p的相對表達量。

1.7.4 Western blot檢測

取部分海馬組織，加入適量RIPA裂解液冰上裂解，12 000 r/min離心15 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳，轉至PVDF膜。脫脂奶粉封閉，加入稀釋的BDNF、Tau、p-TauSer396、p-TauThr231和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h。超敏ECL試劑顯影，凝膠成像系統拍照，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。

1.7.5 免疫組化檢測

取海馬組織石蠟切片，脫蠟至水。3%H2O2室溫封閉10 min，消除內源性過氧化物酶，微波抗原修復后，加入山羊血清封閉15 min。加入稀釋的BDNF、Tau、p-TauSer396、p-TauThr231和β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP標記的二抗，室溫孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復染、脫水、封片，光學顯微鏡下觀察。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 差異microRNA篩選結果

GSE129053數據集共篩選出34個差異miRNA，其中17個上調、17個下調。同時，AD模型3個樣本中miR-103a-3p的表達均上調。結果見圖1、表1。

2.2 安神定志方對模型大鼠學習記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠跨越平臺次數和有效停留時間明顯減少，逃避潛伏期顯著增加，差異均有統計學意義（＜0.05）。與模型組比較，miR-103a-3p mimic組大鼠跨越平臺次數和有效停留時間明顯減少，逃避潛伏期顯著增加，差異均有統計學意義（＜0.05）；安神定志方組大鼠跨越平臺次數和有效停留時間顯著增加，逃避潛伏期顯著減少，差異均有統計學意義（＜0.05）。而安神定志方對AD治療作用部分被miR-103a-3p mimic抵消，miR-103a-3p mimic＋安神定志方組大鼠逃避潛伏期較安神定志方組增加，跨越平臺次數和有效停留時間變化不明顯，差異無統計學意義（＞0.05）。結果見表2。

圖1 GSE129053數據集中差異表達miRNA的火山圖和熱圖

表1 GSE129053數據集中差異表達miRNA

表2 各組大鼠Morris水迷宮實驗結果比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.3 安神定志方對模型大鼠海馬CA1區組織形態的影響

HE染色結果顯示，空白組大鼠海馬CA1區細胞排列整齊，無明顯病理改變；模型組大鼠海馬CA1區神經元數量減少，細胞排列紊亂，細胞核皺縮、變小；miR-103a-3p mimic組大鼠海馬CA1區神經元數量進一步減少，細胞膜與細胞核膜界線消失，胞質染色變深；與模型組比較，安神定志方組大鼠海馬CA1區組織形態明顯改善；miR-103a-3p mimic＋安神定志方組大鼠海馬CA1區組織形態未見明顯改善。見圖2。

2.4 安神定志方對模型大鼠海馬組織miR-103a-3p表達的影響

與空白組比較，模型組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達顯著上調，差異有統計學意義（＜0.05）；與模型組比較，miR-103a-3p mimic組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達顯著上調（＜0.05），安神定志方組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達顯著下調（＜0.05），miR-103a-3p mimic＋安神定志方組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達略降低，差異無統計學意義（＞0.05）。結果見表3。

圖2 各組大鼠海馬CA1區組織形態（HE染色，×200）

表3 各組大鼠海馬組織miR-103a-3p表達比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

2.5 安神定志方對模型大鼠海馬組織腦源性神經營養因子及Tau蛋白表達的影響

通過TargetScan網站（http://www.targetscan.org）預測miR-103a-3p的潛在靶基因，結果顯示，BDNF的3’-UTR與miR-103a-3p存在結合位點。Western blot檢測結果顯示，與空白組比較，模型組大鼠海馬組織BDNF表達顯著降低，p-TauSer396和p-TauThr231表達顯著升高，差異均有統計學意義（＜0.05）；與模型組比較，miR-103a-3p mimic組大鼠海馬組織BDNF表達顯著降低，p-TauSer396和p-TauThr231表達顯著升高，差異均有統計學意義（＜0.05）；安神定志方組大鼠海馬組織BDNF表達顯著升高，p-TauSer396和p-TauThr231表達顯著降低，差異均有統計學意義（＜0.05），miR-103a-3p mimic＋安神定志方組海馬組織BDNF表達略增加，p-TauSer396和p-TauThr231表達略降低，差異無統計學意義（＞0.05）。結果見圖3、表4。

此外，通過免疫組化染色進一步檢測海馬組織BNDF及Tau蛋白的表達，通過Image J軟件對蛋白的平均光密度（IOD值）進行半定量分析，結果與Western blot趨勢相同。同時，各組Tau蛋白表達未見明顯差異。結果見圖4、表5。

注：1.空白組；2.模型組；3. miR-103a-3p mimic組；4.安神定志方組； 5. miR-103a-3p mimic＋安神定志方組

表4 各組大鼠海馬組織BNDF及Tau蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

圖4 各組大鼠海馬組織BNDF及Tau蛋白陽性表達（免疫組化染色，×200）

表5 各組大鼠海馬組織BNDF及Tau蛋白表達比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05；與模型組比較，#＜0.05

3 討論

miRNA是一類長度約為19～24個核苷酸的內源性非編碼RNA，具有高度的保守性和組織特異性，廣泛分布于中樞神經系統，對神經分化和成熟具有重要的調節作用。研究表明，miRNA可直接或間接參與Aβ的代謝、Tau蛋白的磷酸化、神經炎癥、膽固醇代謝、氧化應激和軸突可塑性，進而參與AD的發生與發展[8]。隨著基因芯片技術和RNA測序技術的飛速發展，基于基因表達數據庫的生物信息學分析為發現新的功能性miRNA提供了便利條件。本研究通過GEO數據庫獲取AD大鼠海馬組織中差異表達的miRNA，結果表明AD大鼠34個miRNA存在差異表達。本研究選取miR-103a-3p進行進一步研究。有研究證實，miR-103a-3p在腫瘤和子宮腺肌癥發病中發揮著重要作用[9-14]，但關于miR-103a-3p在AD中的作用迄今尚未見報道。本研究結果表明，Aβ1-42誘導的AD模型大鼠海馬組織miR-103a-3p表達顯著上調，這與GSE129053芯片結果一致。本研究結果還表明，miR-103a-3p mimic尾靜脈注射可顯著升高海馬組織miR-103a-3p的表達，Morris水迷宮實驗和HE染色結果顯示，miR-103a-3p mimic可抑制AD大鼠學習記憶能力，加重海馬神經元的損傷。安神定志方能顯著抑制海馬組織miR-103a-3p的表達，從而促進AD大鼠學習記憶能力和神經元損傷的修復，改善海馬組織形態。

BDNF是一種廣泛分布于海馬組織和大腦皮層的神經營養因子，通過在形態和功能上調控突觸的可塑性，進而影響AD大鼠的學習記憶能力[15]。有研究顯示，AD患者血清和海馬組織BDNF表達顯著降低，并且BDNF水平與AD患者病情嚴重程度呈負相關[16-17]。在神經元中，BDNF通過與酪氨酸蛋白激酶受體B結合，激活MAPK、PI3K/Akt及PLC信號通路，進而促進神經元的增殖、分化與存活[18]。課題組前期研究表明，BDNF是安神定志方治療AD的有效靶點，其可呈劑量依賴性增加AD大鼠海馬組織BNDF的表達。本研究通過TargetScan網站發現BDNF是miR-103a-3p的潛在靶基因。盡管本研究未通過熒光素酶報告基因檢測兩者之間的結合活性，但結合之前的研究結果發現，miR-103a-3p mimic能顯著抑制海馬組織BDNF的表達并干擾安神定志方對BDNF的調控作用。

Tau蛋白是一種微管相關蛋白，主要分布于大腦顳葉、內嗅區和海馬組織的神經元。Tau蛋白的磷酸化主要發生在蘇氨酸和絲氨酸的殘基上，并在磷酸酯酶和磷酸激酶的調控下維持磷酸化和去磷酸化的平衡狀態[19]。研究表明，Tau蛋白異常磷酸化是AD的重要特征之一，同時直接影響Tau蛋白與微管結合的能力，最終導致原纖維絲的形成[20]。本研究通過Western blot和免疫組化檢測AD大鼠海馬CA1區Tau蛋白的表達，結果顯示，miR-103a-3p mimic顯著促進Tau蛋白Ser396和Thr231位點的磷酸化，而安神定志方能顯著抑制p-TauSer396和p-TauThr231的表達，與前期研究結果一致。

綜上所述，安神定志方可能通過抑制miR-103a-3p的表達，進而上調海馬組織BDNF的表達，調控Tau蛋白的磷酸化水平，從而促進AD大鼠學習記憶能力。

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Effects ofPrescription on miR-103a-3p and Its Mediated Phosphorylation of Tau Protein in Hippocampus of Alzheimer Disease Rats

WANG Xinbo1, ZHAO Yu1, YUAN Xingxing2

To investigate the effects ofPrescription on the levels of miR-103a-3p and Tau protein phosphorylation in hippocampus of Alzheimer disease (AD) rats; To discuss its related mechanism of action.Differentially expressed miRNAs in hippocampus of AD were screened by GEO database. 50 SD rats were randomly divided into control group, model group, miR-103a-3p mimic group,Prescription group and miR-103a-3p mimic combined withPrescription group, with 10 rats in each group. The AD rat model was established by intracerebroventricular injection of Aβ1-42. After modeling, each group was given corresponding drug intervention for 4 weeks. Morris water maze test was used to detect the learning and memory ability. HE staining was used to detect the morphological changes of hippocampus. The expression of miR-103a-3p was detected by RT-PCR. The expressions of BDNF and Tau protein in hippocampus were detected by Western blot and immunohistochemistry.A total of 34 miRNAs were screened by GEO database, 17 of which were up-regulated and 17 were down-regulated. Compared with the model group,Prescription could significantly increase the times of crossing platform and effective residence time, reduce escape latency, improve the tissue morphology of hippocampal CA1 area, up-regulate the expression level of BDNF, and inhibit the expression level of miR-103a-3p, p-TauSer396and p-TauThr231, with statistical significance (<0.05).Prescription may promote the expression of BDNF by inhibiting the expression of miR-103a-3p in hippocampus, and regulate the phosphorylation level of Tau protein, thereby promoting the learning and memory ability of AD rats.

Prescription; Alzheimer disease; GEO database; miR-103a-3p; Tau protein phosphorylation; rats

R285.5

A

1005-5304(2021)02-0062-07

10.19879/j.cnki.1005-5304.202007309

黑龍江省自然科學基金面上項目（H2018063）；黑龍江省中醫藥科研項目（21102190005）

袁星星，E-mail：yuanxingxing80@163.com

（收稿日期：2020-07-15）

（修回日期：2020-08-10；編輯：華強）