丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌對廣西黎村黃雞生長性能、腸道形態及盲腸微生物區系的影響

農斯偉 沈水寶 韋曉芳 吳克寧 袁汝喜 藍林誠 伍校軍 韋 區

（1.百色學院教育科學學院，廣西百色533000；2.廣西大學動物科學技術學院，廣西南寧530004）

隨著社會快速發展，人們對食品的安全和質量越來越重視，據農業農村部第194 號公告：2020 年7 月1 日起，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。抗生素給畜禽行業帶來了很多益處，但同時造成了諸多的食品安全問題。因此，尋找抗生素替代品已經成為研究熱點。廣西三黃雞是兩廣地區的土雞代表之一，肉質鮮皮黃薄脆、香味濃郁，是制作白切雞或原味雞的上好品種，但產量和養殖模式存在許多瓶頸，是需要解決的技術難點。目前市場上以快大雞為主，但人們對土雞的味道保持著喜愛。土雞的養殖過程需要一定的運動量和飼養周期才可以沉淀美味和質量，生產上以放養為主，而放養過程中由于環境的不穩定影響，經常出現疾病和使用抗生素治療導致的食品藥物殘留等問題。研究發現飼料中添加丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌都可改善動物腸道的微生物區系平衡，通過競爭抑制有害菌的生長繁殖，且產生的多種代謝產物具有類似抗生素的作用[1-2]。產生的抗菌物質、短鏈∕支鏈脂肪酸（SCFA∕BCFA）、維生素、甾醇類物質、芳香族化合物、胺類物質等，對機體免疫[3]和血液代謝等具有改善作用[4]。彭豫東等[5]在石門土雞中添加枯草芽孢桿菌，發現除了提高屠宰性能外，對機體抗氧化能力和腸道形態都有一定的改善作用；杜云平等[6]分別在肉雞和種雞的飲水中添加1.5×109CFU∕mL的丁酸梭菌，發現肉雞日增重增高4.62%，料肉比下降9.26%，并且可以很好地預防仔雞腸炎。本試驗旨在研究益生菌對廣西黎村黃雞的生長性能和腸道發育的影響，為廣西優質土雞的飼養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

丁酸梭菌（由湖北藍谷中微生物技術有限公司提供，活菌數見表1），復合菌（由北京科為博生物科技有限公司，活菌數見表1）添加量均為廠家指導劑量，并于飼料制粒過程中加入，成品料的活菌測量由北京科為博生物科技有限公司檢測，以上數據為實測值。

表1 添加劑與含量

1.2 試驗動物及飼糧

試驗選用國家畜禽新品種（配套系）認定的廣西“黎村黃雞”，參照NRC（1994）《家禽營養標準》的營養需要的基礎上，根據黎村黃雞的品種特性、飼養管理和營養需求進行調整（見表2）。

1.3 試驗設計與飼養管理

表2 基礎飼糧組成及營養水平（風干基礎）

試驗選用35 日齡，平均體重383.52 g 左右健康、精神狀態良好的廣西黎村黃雞3 000 羽，按照試驗要求隨機分成3 個處理組，每個處理組5 個重復，每個重復200 羽。第一組：基礎飼糧+丁酸梭菌（500 g∕t），第二組：基礎飼糧+復合菌（丁酸梭菌+枯草芽孢桿菌）1 000 g∕t，第三組是對照組為基礎飼糧，正式試驗45 d。本試驗采用籠養方式，飼養管理根據雞場規定進行，人工限飼，自由飲水、溫濕度控制在本階段最適范圍，每天飼喂2 次，分為上午08：00 和下午15：00，并保持雞舍清潔衛生。試驗期間每日記錄料耗和死亡數，試驗開始和結束時禁食12 h，每個重復抽取60羽進行稱重，記錄初重和末重。

1.4 生長性能測定

由于限飼，因此采食量是相對固定，耗料量以實際投飼量計，各組總耗料量一致。

平均日采食量(ADFI，g)=總投料量∕試驗天數

平均日增重（ADG，g）=（末重-初重）∕試驗天數

料重比（F∕G）=總耗料量∕總增重

1.5 屠宰收集樣品

于試驗第45 d，試驗雞禁食12 h。每個重復選1 只體重接近該重復平均體重的供試雞進行屠宰，分別采集十二指腸、空場、回腸各2～3 cm，置于10%甲醛溶液中固定。

1.6 樣品測定及方法

1.6.1 腸道形態測定

取出固定瓶中腸道組織，常規石蠟切片制作，顯微鏡鏡檢，圖像在專業成像系統測量40倍視野下，測量隱窩深度、絨毛高度。

1.6.2 盲腸菌群測定

試驗結束前，禁食12 h，每個重復選取1羽，進行屠宰，取盲腸內容物2～5 g放入凍存管中，迅速轉入-80 ℃液氮中保存待高通檢測測序，對所有盲腸樣本進行總DNA 提取、PCR 擴增和Miseq 測序，數據使用專用軟件進行分析。

1.7 數據整理與分析

數據使用Excel 軟件先統計整理，再用SPSS 22.0軟件對數據計算顯著性分析，用單因素方差分析（one-way ANOVA,）和Duncan's 多重比較檢驗法來對比組間是否差異，結果以“平均值±標準差（X±SD）”表示。用P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，0.05＜P＜0.10表示有差異趨勢。

2 結果與分析

2.1 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞生長性能的影響（見表3）

表3 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞生長性能的影響

由表3 可知，由于飼養過程采取限飼，根據肉雞日齡實行固定遞增投喂量，因此耗料量一致。平均日增重方面，丁酸梭菌組和復合組分別比對照組提高7.25%和6.80%，但差異不顯著（P＞0.05）；同時丁酸梭菌組和復合組的料重比與對照組相比，有降低趨勢，但差異不顯著（0.05＜P＜0.10）。丁酸梭菌組和復合組的死淘率與對照組相比，有降低的趨勢，但差異不顯著（0.05＜P＜0.10）。

2.2 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞腸道形態的影響（見表4）

表4 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞腸道形態的影響

由表4可知，與對照組相比，腸絨毛高度方面，復合組和丁酸梭菌組十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度有提高的趨勢，但差異均不顯著（0.05＜P＜0.10）；隱窩深度方面，復合組和丁酸梭菌組的空腸隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05），且復合組和丁酸梭菌組的回腸的隱窩深度低于對照組，但差異不顯著（0.05＜P＜0.10）；絨毛高度∕隱窩深度方面，復合組和丁酸梭菌組空腸和回腸顯著高于對照組（P＜0.05），其他組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.3 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞盲腸食糜中微生物區系的影響（見表5～表6）

表5 各組黃雞盲腸微生物區系在門水平上的分布（門水平%）

表6 各組黃雞盲腸微生物區系在屬水平上的分布（屬水平%）

由表5可知，80 d黎村黃雞盲腸內優勢菌門為厚壁菌門和擬桿菌門，占據90%左右。其中，丁酸梭菌組厚壁菌門的相對豐度顯著高于復合組和對照組（P＜0.05），而擬桿菌門的相對豐度顯著低于復合組和對照組（P＜0.05）。各組間的變形桿菌門和放線菌門差異均不顯著（P＞0.05）。

從表6 可知，復合組的擬桿菌屬的相對豐度最高，但與其他兩組差異不顯著（P＞0.05）。丁酸梭菌組的另枝菌屬的相對豐度顯著低于復合組和對照組（P＜0.05）。復合組的乳桿菌屬的相對豐度顯著低于丁酸梭菌組和對照組（P＜0.05）。對照組的梭菌屬的相對豐度顯著低于丁酸梭菌組和復合組（P＜0.05）。丁酸梭菌組的瘤胃球菌屬的相對豐度顯著高于復合組和對照組（P＜0.05）。

3 討論

3.1 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞生長性能的影響

研究表明，丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌的代謝產物包括多種活性酶、抗菌肽、短鏈脂肪酸等物質，能夠提高動物對飼料的利用率，改善動物生長性能[7]；肉雞養殖過程中發現丁酸梭菌可以提高肉雞的生長性能[8]，但也有發現丁酸梭菌對肉雞的平均日增重和料重比無顯著影響[9]。本試驗研究發現，在采食量固定的情況下，丁酸梭菌和復合菌的平均日增重有提高的趨勢且料重比都有降低的趨勢，但是差異不顯著（P＞0.05）。這可能是由于采取限飼，提供的營養物質有限，益生菌難以發揮最大的優勢。同時還發現丁酸梭菌組和復合組的生長性能無顯著差異，可能是由于限飼造成枯草芽孢桿菌沒能發揮功能，而丁酸梭菌發揮了主要功能；造成這一現象的機理還要進一步研究證實。丁酸梭菌和復合組的死亡率有所降低，但與對照組差異不顯著（P＞0.05）。

3.2 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞腸道發育的影響

腸道是動物吸收營養的主要場所，是機體內最大的消化、轉運器官，同時也是一道重要的物理防御系統[10]。腸絨毛高度、隱窩深度、絨毛高度∕隱窩深度常作為評定小腸吸收營養物質能力及腸道功能的指標。絨毛高度∕隱窩深度的比值，是小腸對養分的吸收功能的保證，比值小可反映隱窩相對較厚，絨毛上皮細胞更新率減弱，吸收養分能力相對較弱，絨毛高度∕隱窩深度比值大，可在一定程度表明吸收養分能力強。

本研究發現，丁酸梭菌組和復合組十二指腸、空腸、回腸的絨毛高度均優于對照組，但是差異不顯著（P＞0.05）。但在空腸的隱窩深度方面，丁酸梭菌和復合組空腸的隱窩深度顯著低于對照組（P＜0.05）。徐晨希[11]發現，在肉雞飼料中添加丁酸梭菌可顯著降低十二指腸的隱窩深度。本研究發現回腸的隱窩深度也有降低的趨勢，但差異不顯著（P＞0.05），與上述結果相似。齊博等[12]研究發現枯草芽孢桿菌可顯著提高愛拔益加(AA)肉仔雞十二指腸的絨毛高度和絨毛高度∕隱窩深度。同樣地，本試驗發現添加益生菌可顯著提高空腸和回腸的絨毛高度∕隱窩深度（P＜0.05）。但丁酸梭菌組和復合組間無顯著差異（P＞0.05），造成這一現象可能是由于限飼引起的，肉雞攝入量有限，具體機理還有待進一步試驗驗證。

3.3 飼用芽孢桿菌和丁酸梭菌對黎村黃雞盲腸菌群分布的影響

動物腸道是一個開放的生態系統，與外界接觸最為廣泛，在腸道里面存在著許多微生物，這些微生物與宿主免疫防御系統之間經過長期的協同進化，與宿主共生，在維持腸道健康方面起著重要作用。研究表明，腸道中菌群的種類有500 多種，但是這些菌種大部分屬于少數的幾個門類[13-14]。雞腸道中以厚壁菌門為主，其次為擬桿菌門、變形菌門和放線菌門[15]。本試驗研究，黃雞的盲腸微生物中以厚壁菌門、擬桿菌門為主，兩種菌門的占比達到90%左右，其次為變形菌門和放線菌門。據研究發現厚壁菌門與擬桿菌門比值（F∕B）與動物脂類代謝有關聯，F∕B 值增大，動物機體的脂肪沉積較多，這可能是由于厚壁菌門有較強的發酵能力，其產出較多的短鏈脂肪酸和代謝脂類的能力，有利于動物體沉積脂肪[16]。本研究發現各組的優勢菌門主要是厚壁菌門和擬桿菌門，但是兩個處理組的菌群F∕B 比例相差較大，復合組的第一優勢菌門為擬桿菌門，而丁酸梭菌組的第一優勢菌門為厚壁菌門，提示丁酸梭菌組可提高厚壁菌門相對豐度，而復合組提高擬桿菌門相對豐度，這可能是由于復合組中枯草芽孢桿菌促進擬桿菌門的繁殖，從而導致厚壁菌門的相對豐度下降。據報道，擬桿菌門是食草性動物主要的優勢菌門，其功能是分解宿主難以分解的多糖（如粗纖維）、增強草食動物對纖維素的消化，促進物質轉化[17]。提示飼料中添加含有枯草芽孢桿菌的益生素有利于散養雞對粗料的消化和吸收，而單用丁酸梭菌可能不利于散養雞對粗飼料的耐受。

在屬水平上，許多研究表明動物的優勢菌屬主要以擬桿菌屬、梭菌屬、瘤胃球菌屬為主，這些菌群有利于動物對營養物質吸收[18-22]。如擬桿菌屬可促進動物對飼料中淀粉的消化吸收，且對腸道炎癥有一定的調節功能，本研究得出各組間擬桿菌屬相對含量無顯著差異。

另枝菌屬是一種相對較新的細菌屬，主要從醫學臨床樣品中分離出來，盡管與其他細菌類屬相比，其發病率較低，而其他細菌屬與菌群失調和疾病高度相關，但目前的分離方式還不能足以全部區分該屬的物種；從患有闌尾炎，腹部和直腸膿腫的患者中分離出了該屬的各種物種，有研究表明另枝菌屬可能對某些疾病具有保護作用，包括肝纖維化、結腸炎、癌癥免疫療法和心血管疾病，但也有相反的研究證明另枝菌屬在大腸癌中表現為致病性[23]。由于另枝菌屬是擬桿菌屬的一個較新的分支，并且擬桿菌屬通常與慢性腸道炎癥相關。本研究發現丁酸梭菌組的另枝菌屬相對豐度顯著低于其他兩組，且對照組的含量最高，提示丁酸梭菌肉雞對腸道炎癥方面具有良好的保護作用，效果優于復合組。

乳桿菌屬是動物腸道的有益菌群，具有維持動物機體健康和免疫調節功能，能夠利用葡萄糖進行發酵并產生乳酸和乙酸等降低腸道pH，抵御外來入侵，促進其他有益菌的生長繁殖，調節腸道功能及營養的吸收利用。本研究發現丁酸梭菌組的乳桿菌屬相對含量最高，顯著高于復合組；提示丁酸梭菌可提高肉雞腸道乳桿菌屬的含量，而含有枯草芽孢桿菌的丁酸梭菌復合組不利于乳桿菌屬的生長繁殖。

梭菌屬和瘤胃球菌屬可促進動物機體對飼料中纖維和碳水化合物的消化吸收。本試驗添加有丁酸梭菌菌種，因此兩個處理組的梭菌屬含量顯著高于對照組，提示添加丁酸梭菌和復合丁酸梭菌均可以提高肉雞對營養物質的消化吸收，生長性能的平均日增重的結果進一步證實了這一結論。丁酸梭菌組的瘤胃球菌屬顯著高于其他兩組，提示丁酸梭菌可促進瘤胃球菌屬的生長繁殖，而復合丁酸梭菌組對于瘤胃球菌屬的生長繁殖能力較弱。

4 結論

研究表明丁酸梭菌和枯草芽孢桿菌均有提高動物的生長性能，促進動物腸道健康以及提高動物機體免疫。本試驗條件下添加丁酸梭菌和復合丁酸梭菌均有提高小腸絨毛的高度、提高梭菌屬、瘤胃球菌屬、乳桿菌屬的相對豐度，促進黃雞對飼料中纖維和碳水化合物等營養物質的消化吸收，改善黎村黃雞腸道健康和生長性能。添加丁酸梭菌和丁酸梭菌+芽孢桿菌組對擬桿菌、梭菌屬、瘤胃球菌屬、乳桿菌屬等分布有一定的影響，但各組的各菌屬間無規律性變化。