2019年冬季江蘇部分地區(qū)雞傳染性支氣管炎病毒S1基因遺傳進(jìn)化分析

冷 梅 ， 唐 爽 ， 練家敏 ， 邵冠明 ， 謝青梅 ， 藺文成

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 廣東 廣州 510000)

雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)屬于冠狀病毒科(Coronavrindac)γ冠狀病毒屬(Coronavirus)[1]，是一種單股正鏈RNA病毒。IBV基因組易發(fā)生重組、變異，導(dǎo)致新的變異株不斷產(chǎn)生，給該病的防控帶來了巨大的挑戰(zhàn)。S1基因是IBV的基因分型依據(jù)，其編碼的S1蛋白是IBV的主要免疫原蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[2-7]，因此通過比較分析毒株的S1基因序列，就可以了解IBV基因型的流行趨勢(shì)以及毒株的變異情況，為雞傳染性支氣管炎(IB)的防控以及研制新型疫苗提供參考。

1 材料與方法

1.1 病料和雞胚 從江蘇省常州、鹽城、連云港3個(gè)地區(qū)的雞場(chǎng)采集疑似感染雞傳染性支氣管炎病料23份，主要為氣管、肺臟、腎臟、輸卵管、肝臟等組織。試驗(yàn)用SPF雞胚(9～11日胚齡)，購自廣東新興大華農(nóng)禽蛋有限公司SPF實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 核酸抽提試劑盒、一步法RT-PCR試劑盒和pMD19-T Vector Cloning Kit，均購自TaKaRa公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞和DNA聚合酶LATaq，均購自Tiangen生物公司。

1.3 毒株的分離鑒定

1.3.1 病毒分離 (1)病料的處理：將病料剪碎、研磨成勻漿后，按1∶5比例加入滅菌PBS緩沖液制成懸液，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心5～10 min，取上清液用濾器過濾除菌后備用。(2)雞胚接種：濾液按0.2 mL/枚經(jīng)尿囊腔各接種3枚9～11日齡的雞胚(同時(shí)PBS接種2枚作為對(duì)照)，置37 ℃孵育，每天照胚3次，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，繼續(xù)孵育至48 h。將雞胚置于4 ℃冰箱過夜或者-20 ℃、30 min后無菌抽取尿囊腔液，并將同一病料接種后收獲的尿囊液混合，繼續(xù)盲傳3代，收集并分裝F3代尿囊液然后放置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病毒鑒定 (1)血凝試驗(yàn)(HA)：在96孔“V”型板微孔板上每孔滴加PBS緩沖液50 μL，加入50 μL待測(cè)抗原(尿囊液)于第1列孔中，反復(fù)吹打幾次混勻后吸50 μL至第2孔，依次倍比稀釋至倒數(shù)第2列，最后1列不加抗原作為對(duì)照；再加入0.1%雞紅細(xì)胞懸液50 μL/孔，置微型混合器上震蕩30 s或以手持血凝板繞圓圈混勻；置37 ℃恒溫箱中10～15 min。將反應(yīng)板豎立起來，若紅細(xì)胞呈淚滴狀流動(dòng)者為沉淀，表明為凝集；若紅細(xì)胞鋪平孔底，凝集成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，表示紅細(xì)胞被病毒凝集。完全凝集的抗原最高稀釋倍數(shù)即為HA效價(jià)。(2)雞胚發(fā)育受阻試驗(yàn)：盲傳3～5代后HA陰性的尿囊液接種9 ～11日齡的SPF雞胚的尿囊腔，每份樣品接種兩組：一組孵化48 h后收集尿囊液；另一組繼續(xù)孵化至17～19日齡，觀察胚體發(fā)育情況。雞胚發(fā)育受阻判斷標(biāo)準(zhǔn)：雞胚發(fā)育遲緩，表現(xiàn)出蜷曲胚，趾爪變形并緊抱頭部，羊膜增厚緊貼雞胚，尿囊液中有白色的尿酸鹽結(jié)晶，腎小管、輸尿管有白色尿酸鹽沉積。(3)RT-PCR鑒定：根據(jù)核酸提取試劑盒說明書的方法提取尿囊液的病毒核酸，通過RT-PCR鑒定，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.4 基因克隆與測(cè)序 根據(jù)GenBank已發(fā)表的S1基因序列設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列參考文獻(xiàn)[5]設(shè)計(jì)：S1-F:5′-AAGACTGAACAAAAGACCGACT-3′；S1-R:5′-CAAAACCTGCCATAACTAACATA-3′。引物由北京華大基因科技有限公司合成。將23株IBV分離株的S1基因通過RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，將RT-PCR產(chǎn)物回收純化以后，連接到pMD19-T載體上，再轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細(xì)胞，在含Amp抗性LB平板上培養(yǎng)12 h后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性樣品委托北京華大基因科技有限公司測(cè)序。

1.5 IBV分離株S1基因的進(jìn)化分析 用DNASTAR和MEGA 5.2生物學(xué)軟件對(duì)23株IBV分離株的S1基因序列及推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行分析。IBV參考毒株及其GenBank登錄號(hào)如下：DY05(GQ265928)、YX10(JX840411)、A2(AY043312)、QXIBV(AF194323)、LX4(AY338732)、SAIBK(DQ288927)、HN08(GQ265940)、TA03(AY837465)、D90(MF508703.1)、QXL87(MH743141)和7/93(Z83979)。

1.6 IBV分離毒株的重組分析 利用重組檢測(cè)程序4(RDP v.4.97)軟件對(duì)IBV分離株S1基因進(jìn)行假定重組分析。共采用RDP、GENECONV、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、PhyLPro、LARD和3Seq共9種方法分析假定的重組事件。重組事件只要有5種方法支持且P值調(diào)整到0.05，那么可以認(rèn)為結(jié)果為陽性。通過SimPlot軟件(3.5.1版)進(jìn)一步驗(yàn)證了潛在的重組事件。

2 結(jié)果

2.1 IBV分離株S1基因的遺傳進(jìn)化分析 23個(gè)IBV分離株S1基因核苷酸序列已上傳至 GenBank，所獲得注冊(cè)序列號(hào)見表1。通過對(duì)23個(gè)IBV分離毒株與11個(gè)參考株的S1基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，23個(gè)分離毒株中有16個(gè)QX型分離株和7個(gè)HN08型分離株。QX型分離毒株又分為Cluster Ⅰ亞分支(8個(gè)，50.0%)、Cluster Ⅱ亞分支(6個(gè)，37.5%)和Cluster Ⅲ亞分支(2個(gè)，12.5%)。見圖1。

表1 2019年江蘇地區(qū)IBV分離毒株及S1基因信息Table 1 Details of IBV isolates and S1 gene from Jiangsu province in 2019

圖1 江蘇地區(qū)IBV分離株與參考株S1基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of S1 gene of IBV isolates and reference strains from Jiangsu province●:分離毒株； ○:重組分離毒株●:Isolated strains; ○:Isolated strains of recombination

2.2 IBV分離株S1基因同源性分析 由表1可知，23個(gè)IBV分離株S1基因核苷酸序列長(zhǎng)度介于1 610～1 641 bp,分別編碼536～547個(gè)氨基酸，說明分離毒株的堿基存在一定插入和缺失。23個(gè)IBV分離毒株與11個(gè)IBV參考株S1基因核苷酸序列一致性為77.0%～99.9%，氨基酸一致性為66.2%～99.8%，分離毒株與參考株間的一致性差異大。23個(gè)IBV分離毒株之間S1基因核苷酸序列一致性為82.9%～99.9%，氨基酸一致性為79.2%～99.7%。QX型為IBV主要流行基因型，此型3個(gè)亞分支分離毒株間S1基因核苷酸序列一致性為96.0%～99.8%，氨基酸序列一致性94.3%～99.6%。Cluster Ⅰ亞分支分離毒株間S1基因核苷酸序列一致性為97.9%～99.8%，氨基酸一致性為96.5%～99.6%。Cluster Ⅱ亞分支分離毒株間S1基因核苷酸序列一致性為97.2%～99.6%，氨基酸一致性為96.3%～99.3%。Cluster Ⅲ亞分支分離毒株間S1基因核苷酸序列一致性為99.8%，氨基酸一致性為99.6%。Cluster Ⅰ亞分支分離毒株和Cluster Ⅱ亞分支分離毒株的S1基因核苷酸序列和推導(dǎo)氨基酸序列同源性差異度比Cluster Ⅲ分離株大，經(jīng)比對(duì)Cluster Ⅰ亞分支分離毒株和Cluster Ⅱ亞分支分離毒株的S1基因核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)它們的核苷酸發(fā)生了部分位點(diǎn)的增添和缺失以及個(gè)別位點(diǎn)的突變。HN08型分離毒株間S1基因核苷酸序列一致性為99.0%～99.8%，氨基酸一致性為98.4%～99.6%，同源性較高。

2.3 變異株的重組分析 通過對(duì)連云港市IBV分離株CKCHJSLYG1912-5的S1基因重組分析發(fā)現(xiàn)，假定親本HN08型SAIBK毒株與QX型QXL87毒株S1基因發(fā)生基因重組，重組片段長(zhǎng)度為120 bp，見表2。

表2 變異株CKCHJSLYG1912-5的S1基因重組事件信息Table 2 S1 gene recombination events in CKCHJSLYG1912-5

3 討論

江蘇省是我國(guó)重要的養(yǎng)禽大省，而其中連云港、常州、鹽城3個(gè)地區(qū)的存欄量較多。本試驗(yàn)通過對(duì)2019年冬季江蘇地區(qū)23份臨床樣品進(jìn)行病毒分離鑒定，檢測(cè)到23份IBV陽性樣品。分離毒株與參考株間的一致性差異大，猜測(cè)S1基因的多樣性差異可能是目前導(dǎo)致免疫失敗的一個(gè)重要原因。2011—2019年本實(shí)驗(yàn)室對(duì)江蘇地區(qū)IBV分離株鑒定發(fā)現(xiàn)，QX型占57%，為主要流行基因型，這與國(guó)內(nèi)QX型流行情況一致[8]，TW Ⅰ型占17%、4/91型占3%、Mass型占13%、CH Ⅲ型占10%[9]。本試驗(yàn)分離的IBV毒株中，QX型仍為主流基因型，值得注意的是，HN08型IBV分離株所占比例較大，揭示了江蘇地區(qū)IBV優(yōu)勢(shì)基因型，為該地區(qū)的IB防控提供參考。臨床上依然是以腎型IBV為主，少量呼吸型IBV，發(fā)病季節(jié)也多為寒冷潮濕的11月份和12月份，因?yàn)槎镜倪^度保暖導(dǎo)致雞舍通風(fēng)不良，空氣質(zhì)量差，這些都是IB爆發(fā)的主要誘因。本試驗(yàn)對(duì)江蘇省3個(gè)地區(qū)(連云港、鹽城、常州)IBV分離毒株的S1核苷酸序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)23株分離毒株與11株參考毒株之間的同源性差異較大，說明江蘇地區(qū)IBV分離毒株的S1基因在不斷發(fā)生進(jìn)化，而且出現(xiàn)了亞分支，這將會(huì)給該地區(qū)IB的防控帶來新的難題。不同地區(qū)毒株向著不同的基因型進(jìn)化，呈現(xiàn)出一定的地域性，該現(xiàn)象與其他學(xué)者研究結(jié)果相似[10]。在本試驗(yàn)的分離毒株中QX型是主流基因型(70.0%)，QX型的亞分支Cluster Ⅰ、Cluster Ⅱ以及Cluster Ⅲ分離毒株分布比較集中，說明同亞分支毒株間親緣性強(qiáng)。相同基因型的分離毒株間一致性較高，說明該地區(qū)相同基因型的毒株同源性強(qiáng)。對(duì)各個(gè)基因型分離毒株裂解位點(diǎn)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，QX型分離毒株裂解位點(diǎn)有HRRRR(12株)和HRHRR(4株)；HN08型分離毒株裂解位點(diǎn)全部為HRRRR(7株)；表明裂解位點(diǎn)與基因型沒有必然聯(lián)系。

對(duì)CKCHJSLYG1912-5毒株的S1基因重組分析發(fā)現(xiàn)，HN08型SAIBK毒株與QX型QXL87疫苗株S1基因發(fā)生了重組，揭示了連云港地區(qū)減毒活疫苗的使用是IBV發(fā)生重組的關(guān)鍵因素，由于發(fā)生重組片段僅有120 bp，所以該毒株沒有單獨(dú)形成進(jìn)化分支。目前減毒活疫苗仍是防控IB的主要手段[11-12]，其優(yōu)點(diǎn)是能誘導(dǎo)機(jī)體高效的免疫應(yīng)答，但在免疫雞群中持續(xù)存在，成為IBV重組的供體。長(zhǎng)期的流行病學(xué)監(jiān)測(cè)可為該地區(qū)疫苗選擇提供依據(jù)，降低IBV重組的概率。