北京郊區長角血蜱攜帶立克次氏體、泰勒蟲的分子檢測

王 業 ， 張慶勛 ， 李 英 ， 袁國輝 ， 韓姝伊 ， 何宏軒

(1.中國科學院動物研究所 , 北京 朝陽 100101 ； 2.青海大學農牧學院 ， 青海 西寧 810016)

蜱是一種體表寄生的吸血性節肢動物，廣泛分布于世界各地，對人類及動物健康存在較大威脅。全球約有近900種蜱，我國已知的蜱類有130余種，包含硬蜱科的7屬120余種和軟蜱科的3屬10余種[1]。有超過28種蜱能引起多種人類疾病[2]。此外，蜱類還可作為多種病原體(細菌、病毒和原生動物)的傳播媒介和儲存宿主，可以攜帶和傳播多種病原體，除引起人和動物過敏反應、刺激和皮膚損傷外[3-4]，還可引起人與動物的梨形蟲病(Piroplasmosis)、立克次氏體病(Rickettsiosis)和無形體病(Anaplasmosis)，對全球人類和動物都具有重要的意義[4-5]。長角血蜱(Haemaphysalislongicornis,H.longicornis)屬于硬蜱科的一種，廣泛分布于世界各地[2]，在我國大部分地區均有分布，也是北京地區的優勢蜱種，是人類和動物疾病的重要載體，可以攜帶無形體屬(Anaplasmaspp.)、埃立克體屬(Ehrlichiaspp.)、巴貝斯屬(Babesiaspp.)、螺旋體屬(Spirochaeta)、柯克斯體屬(Coxiella)和立克次體屬(Rickettsiaspp.)等多種病原體[2]。王亞偉等[6]曾在北京的長角血蜱中檢測出A.capra，盡管長角血蜱是北京地區的優勢蜱種，但對于其攜帶的蜱傳病原體的研究仍非常有限，為了解北京地區長角血蜱攜帶蜱傳病原體的情況，本試驗采用分子流行病學研究的方法對北京郊區的長角血蜱攜帶立克次氏體、無形體、梨形蟲等情況進行調查，為北京地區蜱傳疾病的防控提供科研和數據支持。

1 材料與方法

1.1 蜱蟲樣品的采集 2019年7月從北京市昌平區使用布旗法在草地上采集蜱樣品共計134只。標記時間、地點、日期等信息，裝入采蜱專用的10 mL離心管內，送回實驗室進行蜱的形態學鑒定及基因組DNA的提取。

1.2 蜱的形態學鑒定 按照對蜱的描述，在體視顯微鏡下進行形態學鑒定，同時對蜱進行分類。

1.3 組織DNA提取 將分類后的蜱每5只分為一組，置于1.5 mL離心管中，以PBS洗滌，重復2次。之后使用75%酒精對蜱進行消毒，重復2次。然后棄去酒精，待晾干后用研缽將其組織磨碎，使用天根生化科技有限公司的血液/組織DNA提取試劑盒提取蜱的組織DNA。

1.4 PCR引物的合成 根據蜱的16S rDNA基因，參照文獻[7]設計蜱種屬鑒定的引物；根據梨形蟲18S rRNA基因，參照文獻[10-11]設計梨形蟲鑒定的通用引物；根據立克次氏體OmpA基因，參照文獻[12-13]設計立克次氏體鑒定的引物。所有引物均由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物信息見表1。

表1 蜱種屬及無形體、梨形蟲和立克次氏體檢測引物Table 1 Primers for identification of tick species, Anaplasma spp., Piroplasma spp.and Rickettsia spp.

1.5 蜱蟲的分子鑒定 對經形態學鑒定為長角血蜱的蜱蟲使用引物16S rDNA-F和16S rDNA-R對其16S rDNA基因進行擴增，采用50 μL的反應體系:2×TaqDNA 聚合酶25 μL，16S rDNA-F和16S rDNA-R各1 μL(10 μmol/L)，DNA 3 μL，補足水至50 μL。反應條件：94 ℃，5 min;94 ℃預變性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃終延伸5 min。PCR反應結束后，取5 μL PCR產物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，然后使用凝膠成像儀觀察電泳結果，將符合目的條帶大小的PCR產物經膠回收后送北京六合華大基因科技有限公司進行測序。

1.6 立克次氏體、梨形蟲和無形體的分子鑒定 首先使用引物Piro1-S和Piro3-AS進行第1輪PCR反應，采用15 μL的反應體系:2×TaqDNA 聚合酶7.5 μL，Piro1-S和Piro3-AS各0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 3 μL，加水補足15 μL。反應條件：94 ℃，5 min;94 ℃預變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共35個循環；72 ℃終延伸10 min；待第1輪反應結束后，以第1輪的PCR產物為模版，使用引物PIRO-A1P和PIRO-B進行第2輪PCR反應，反應體系及反應條件同1.5，退火溫度為55 ℃，對梨形蟲進行檢測。無形體使用引物EHR16SD和16S rDNA-R，立克次氏體使用引物Rr190.70和Rr190.701，按照表1的反應條件進行PCR，電泳及測序同1.5。

1.7 序列分析及系統發育樹的構建 將測序得到的結果使用BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)與NCBI數據庫中的蜱蟲、梨形蟲以及立克次氏體序列進行同源性比對，然后利用軟件MEGA 7.0中的Neighbour-Joining方法構建系統發育進化樹，采用Bootstrap分析，繪圖重復參數為1 000，分析遺傳進化關系。

2 結果

2.1 蜱蟲的形態學鑒定 從體型上可以看出該蜱為小型蜱，體色單一，有緣垛，假頭基為四方形，呈矩形，第2節須肢向外伸展形成角突，無眼，盾板有色斑且分布均勻，基節Ⅱ～Ⅳ內距稍大，口下板齒式為 5/5，氣孔板近似圓形，符合長角血蜱的特征。

2.2 蜱的分子鑒定 經PCR擴增和電泳鑒定后得到與蜱蟲線粒體16S rDNA基因相符的約455 bp的目的片段，與預期大小相符(圖1)。經BLAST比對，發現本試驗鑒定的長角血蜱與河北(KJ710068)鑒定的長角血蜱的相似性最高，為99.74%，與江西(MG696723)的相似性最低，為98.30%，與河南(KX450305)和北京(KC203357)的相似性為99.48%，與湖北的相似性為98.43%。

圖1 蜱16S rRNA基因的PCR擴增Fig.1 PCR detection of tick 16S rRNA geneM：DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1～12：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

2.3 無形體、立克次氏體及梨形蟲的檢測 經PCR擴增和電泳鑒定，所有樣本的無形體檢測均為陰性，有8個梨形蟲樣品的目的片段與梨形蟲18S rRNA基因的大小相同，約430 bp(圖2),陽性率為29.63%；得到的立克次氏體的目的片段有21個和OmpA基因的片段大小相符，陽性率為77.78%(圖3)。經BLAST比對，發現本試驗分離得到的梨形蟲均為綿羊泰勒蟲，立克次氏體為未定種。其中，綿羊泰勒蟲與突尼斯(KM92442)在綿羊血液中檢測到的相似度最高，為99.48%，與新疆(FJ603460)、伊朗(KX273858)和土耳其(KU714608)在綿羊中分離的相似率為98.98%。

圖2 梨形蟲18S rRNA基因的PCR擴增Fig.2 PCR detection of Piroplasma 18S rRNA geneM：DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1～12：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

圖3 立克次氏體OmpA基因的PCR擴增Fig.3 PCR detection of Rickettsia OmpA geneM：DL-2 000 DNA相對分子質量標準； 1～12：樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1-12:Sample

2.4 系統進化分析 基于蜱蟲的16S rDNA基因和綿羊泰勒蟲的18S rRNA基因構建系統進化樹，發現其與其他的長角血蜱聚集在同一分支，種群的遺傳距離非常近(圖4)，說明本試驗所收集的蜱確為長角血蜱。根據綿羊泰勒蟲的18S rRNA基因部分核苷酸序列進行系統發育分析，發現此次檢測到的泰勒蟲為綿羊泰勒蟲(圖5)。根據立克次氏體的OmpA基因部分核苷酸序列進行系統發育分析，得到如圖6所示的系統進化樹，發現分離到的立克次氏體和CandidatusRickettsiajingxinensis聚集在同一分支，說明此次分離到的立克次氏體為jingxinensis立克次氏體候選種(Ca.R.jingxinensis)。

圖4 長角血蜱16S rDNA基因的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of H.longicornis 16S rDNA gene ▲:本試驗獲得的長角血蜱序列▲:Sequence of H.longicornis obtained in this study

圖5 基于綿羊泰勒蟲18S rRNA基因的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of T.ovis 18S rRNA gene▲:本試驗獲得的T.ovis序列▲:Sequence of T.ovis obtained in this study

3 討論

本試驗從北京市郊區獲得的蜱為長角血蜱(H.longicornis)，在其體內檢測出綿羊泰勒蟲(T.ovis)和jingxinensis立克次氏體候選種共2種蜱傳病原體，無形體在所有的樣品中均未檢出。從進化樹中可以看到我國不同省份的長角血蜱的種群的遺傳距離非常近，這與Jia等[2]的研究結果較為符合，說明長角血蜱的選擇是為了分散，從而占據不同的生態系統，而不是為了地方競爭力。

隨著分子生物學技術的發展，更多的立克次氏體不斷被人們所發現，其中有些甚至可以引起人類感染。在20世紀30年代，俄羅斯遠東地區有人感染立克次氏體西伯利亞亞種(Rickettsiasibiricasubsp)[14]，這是關于其最早的描述。自此，斑點熱群(SFG)立克次體病陸續在俄國、中國和哈薩克斯坦被發現[15-16]。BJ-90是R.sibirica的亞種，1990年首次從我國的中華革蜱(Dermacentorsinicus)中分離出來，并于2013年和2016年分別在哈爾濱和北京的患者體內被分離出來，感染原因則是因為被蜱蟲叮咬[17]。本試驗中發現的Ca.R.jingxinensis為近年來發現的新種，目前已在多種蜱中被檢出，有報道顯示在人類中發現了一種屬于Ca.R.jingxinensis的變種[18]。因此，盡管目前尚未證實其致病性，但仍應引起重視。T.ovis經常在蜱和小反芻動物中被檢測到，其在綿羊體內感染率可以達到78%[19]。此外，在牦牛和藏羊中也有T.ovis感染的報道[20]。本試驗是首次在北京地區的長角血蜱中檢出T.ovis。泰勒蟲病是一種由泰勒蟲感染引起的重要的家畜傳染病，在我國有20多個省市都有關于泰勒蟲感染的報道[21]。除T.ovis外，T.luwenshuni和T.uilenbergi等多種泰勒蟲都曾在山羊和綿羊中被報道[22]。另外，值得注意的是，雖然本試驗未發現無形體的感染，但鑒于此前曾在北京的H.longicornis中檢測出A.capra，此外，Anaplasmaovis和Anaplasmaphagocytophilum等無形體也都可以引起人類 感 染。如2009年的一項血清學調查顯示，我國A.phagocytophilum的感染率為15.4%，其中農民受到感染的風險大大增加，然而，即使在城市居民中，也存在感染A.phagocytophilum的風險[23]。

圖6 基于立克次氏體OmpA基因的系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of Rickettsia OmpA gene ▲:本試驗獲得的立克次氏體序列▲:Sequence of Rickettsia obtained in this study

北京作為我國的首都，城區人口眾多，郊區成為人們平時娛樂休閑的主要旅游去處。而郊區自然環境復雜，生態多樣，這也增加了人們暴露的風險，進而有被蜱蟲叮咬的危險，從而感染蜱傳病。因此，應該加強對北京周邊地區蜱的種類多樣性及其攜帶病原體的流行病學調查，有關部門應該加強主動監測，防止人和動物被蜱叮咬而感染。