豬Viperin的C末端結構域促進PEDV RNA合成

董建國 ， 陳明睿 ， 饒 丹 ， 何書海 ， 焦鳳超 ， 張廣強 ， 鄧凱偉 ， 黃 立 ， 趙攀登

(1. 信陽農林學院牧醫工程學院 ， 河南 信陽 464000 ； 2. 河南牧業經濟學院動物醫學院 ， 河南 鄭州 450046)

豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea,PED)于1971年在英國首次暴發，隨后傳播到世界許多國家，呈地方流行性[1-4]。2010年以后，我國許多養殖場發生嚴重腹瀉，感染率高達100%，發病仔豬死亡率高達80%～100%，給我國養豬業造成嚴重的經濟損失。研究顯示，目前豬只的腹瀉主要是由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)變異毒株引起[5-6]。

干擾素誘導內質網關聯病毒抑制蛋白(Virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum associated,interferon inducible，Viperin)是干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)表達的蛋白之一[7]。該蛋白屬于內質網相關蛋白，全長由361個氨基酸組成，包括3個關鍵的功能區。第1個功能區是N端，有助于細胞中Viperin蛋白的定位。第2個功能區位于Viperin中間區域，稱為SAM 結構域[7]。第3個功能區是Viperin的 C-末端，該區域高度保守，具有抗病毒功能[8]。本試驗通過擴增豬Viperin基因，構建Viperin各功能區質粒，轉染Vero E6細胞研究Viperin各功能區對PEDV RNA合成的影響，為進一步研究宿主細胞中Viperin調控PEDV感染機制提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 Vero E6細胞和PEDV GDgh 毒株由國家豬業工程技術中心豬病研究室(后文簡稱本實驗室)保存[9]；質粒pWPXL，購自Addgene公司；Lipofectamine?LTX，購自 Invitrogen 公司；化學發光檢測試劑盒(RPN2135)，購自GE Healthcare 公司；細胞裂解液(RIPA)(P0013)、PMSF(ST506)和 DAPI(C1005)，均購自碧云天公司；PrimeSTARTMHS DNA Ploymerase PCR 擴增酶，購自寶生物工程(大連)有限公司；Wizard?Plus Midipreps DNA Purification System和蛋白酶K，均購自Promega公司；T4 DNA 連接酶、SupperMixTaqDNA聚合酶、dNTPs、DL2 000 Plus和DNA瓊脂糖膠回收試劑盒，均購自北京全式金生物技術有限公司。

1.2 引物的設計與合成 參考GenBank 中已經發布的Viperin基因(登錄號：NM_213817.1)序列信息，設計合成擴增豬Viperin基因各功能區的引物序列，進行PCR擴增及片段回收，最后將擴增片段連接到pWPXL載體上，載體上有GFP標簽，位于多克隆位點后面，與插入基因融合表達，引物序列V△CF：AGCTTTGTTTAAACACCATGTGGACACTGGTAC，V△CR：CGCGCGACGCGTAAGGCCACTTTATAATCCCT，用于擴增Viperin△C結構域；V△NF:AGCTTTGTTTAAACACCATGGGGGGTGATAGGAGCC，V△NR:CGCGCGACGCGTAACCAGTCCAGCTTCAGGTC，用于擴增Viperin△N結構域；V△SAMF:AGCTTTGTTTAAACACCATGTGGACACTGGTAC，V△SAMR:CGCGCGACGCGTAACCAGTCCAGCTTCAGGTC，用于擴增Viperin△SAM結構域。以上引物均由蘇州金維智科技有限公司合成。

1.3 重組表達質粒的構建 用以上引物以實驗室保存的pWPXL-Viperin質粒為模板，擴增Viperin各功能域，并進行膠回收，用限制性內切酶PmeI和MluI將回收的各個功能域片段在37 ℃下酶切4 h，隨后將酶切產物回收純化，回收的片段與pWPXL質粒進行連接，連接產物轉化TOP10感受態細胞，于37 ℃下搖菌45 min，接著3 000 r/min離心2 min，棄掉上清，將菌液涂于含氨芐霉素的 LB 平板上，隨后將平板放置于37 ℃培養箱進行過夜培養。將鑒定陽性的菌落擴增，提取質粒，分別命名為 pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C，并送蘇州金維智科技有限公司進行測序。

1.4 重組蛋白質的免疫熒光和蛋白印跡鑒定 6孔板培養Vero細胞，待細胞密度達到70%～80%時，將重組質粒pWPXL、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C(重組質粒帶有GFP標簽)轉染Vero E6細胞。每個質粒各做1個重復，1份用無水乙醇固定，熒光顯微鏡觀察蛋白表達情況；另1份轉染36 h后將Vero E6細胞收集，裂解后加入 Loading buffer，煮沸10 min，離心取上清進行 SDS-PAGE試驗和Western Blot試驗，PVDF膜于脫脂乳中室溫封閉 2 h，隨后加入GFP-Tag mAb室溫孵育2 h，洗滌3次，加入羊抗小鼠IgG-HRP，室溫輕搖0.5 h，洗滌3次，將顯色液均勻滴加到PVDF膜上，用FluorChem E型凝膠成像儀顯色。

1.5 Viperin對PEDV增殖的影響 Vero E6細胞轉染pWPXL、pWPXL-Viperin質粒，轉染后12 h接種PEDV(MOI=0.1)，分別于感染后36 h和48 h收取細胞和上清，-20 ℃反復凍融3次，離心去除沉淀，收集上清，提取培養液中的核酸，熒光定量PCR檢測PEDV拷貝數，確定Viperin基因過表達對PEDV增殖的影響，熒光定量PCR為TaqMan探針法，引物基于PEDVN基因進行設計，上游引物F：AACAACCTTCCAATTGGCATT；下游引物R：AACCCAGAAAACACCCTCAGT；探針：CTACTACCTYGGAACAGGACCTCACGG。

1.6 siRNA干擾Viperin基因對PEDV增殖的影響 針對猴Viperin基因(登錄號：XM_005576618)序列設計3對siRNA分別干擾Vero E6細胞中的Viperin基因(表1)，干擾后24 h收集細胞檢測干擾效果；同時，對干擾的Vero E6細胞接種PEDV(MOI=0.1)，分別于感染后36 h和48 h收取細胞和上清，-20 ℃反復凍融3次，提取培養液中的核酸，熒光定量PCR檢測PEDV拷貝數，確定siRNA干擾Viperin基因對PEDV增殖的影響。

表1 干擾Viperin基因的siRNA序列信息Table 1 siRNA sequence for interfering Viperin gene

1.7 Viperin各功能區對PEDV增殖的影響 Vero E6細胞轉染pWPXL、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C質粒，轉染后12 h接種PEDV(MOI=0.1)，分別于感染后36 h和48 h收取細胞和上清，-20 ℃反復凍融3次，提取培養液中的核酸，熒光定量PCR檢測PEDV拷貝數，確定Viperin各功能域對PEDV增殖的影響。

2 結果

2.1 重組質粒的構建與鑒定 Viperin共包括3個功能區，C末端區域、N末端區域和Sam區域，Viperin△C是缺失C末端區域，Viperin△N是缺失N末端區域，Viperin△Sam是缺失Sam區域，各功能區如圖1所示。用1.2中引物進行片段擴增，隨后回收片段并用PmeI和MluI進行雙酶切，連接后轉化 TOP10感受態細胞，培養12～16 h，挑取陽性菌落擴增，提取質粒進行雙酶切鑒定，結果表明Viperin基因成功克隆至 pWPXL 中(圖2)，將重組質粒命名為 pWPXL-Vip。隨后進行測序，證實Viperin基因正確插入質粒中。

圖1 Viperin各截短蛋白示意圖Fig.1 Schematic diagram of each truncated Viperin protein

圖2 Viperin各截短片段質粒酶切鑒定圖Fig.2 Enzyme digestion identification map of each fragment plasmid of Viperin1：DNA Marker 10 000 bp; 2：pWPXL-Viperin△N; 3：pWPXL-Viperin△N雙酶切; 4：pWPXL-Viperin△C; 5：pWPXL-Viperin△C雙酶切; 6：pWPXL-Viperin△SAM; 7：pWPXL-Viperin△SAM雙酶切1:DNA Marker 10 000 bp; 2:pWPXL-Viperin△N; 3:Double enzyme digestion of pWPXL-Viperin△N; 4:bpWPXL-Viperin△C; 5:Double enzyme digestion of pWPXL-Viperin△C; 6:pWPXL-Viperin△SAM; 7:Double enzyme digestion of pWPXL-Viperin△SAM

2.2 重組蛋白的免疫熒光鑒定 將構建成功的重組質粒分別轉染Vero E6細胞，于轉染后24 h 進行免疫熒光試驗，如圖3所示，各個轉染細胞均有特異性熒光，完整蛋白Viperin、截短蛋白Viperin△C和Viperin△Sam在細胞質中表達，Viperin△N在細胞質和細胞核中均有表達。

圖3 重組蛋白的熒光鑒定Fig.3 Fluorescence identification of recombinant protein

2.3 重組蛋白的Western Blot鑒定 運用Western Blot試驗檢測Vero E6細胞中各個截短蛋白的表達情況，結果顯示完整蛋白Viperin、截短蛋白Viperin△N、Viperin△C和Viperin△Sam有特異性條帶，表明在細胞中正確表達(圖4)。

圖4 Western Blot檢測Viperin各截短蛋白在Vero細胞中的表達Fig.4 Western Blot analysis of each truncatedViperin protein in Vero cells

2.4 過表達Viperin對PEDV增殖的影響 為了確定Viperin對PEDV增殖的影響，pWPXL、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM、pWPXL-Viperin△C質粒轉染Vero E6細胞，于轉染后24 h用PEDV (MOI=0.1)接種細胞，分別于接種后36 h和48 h收集上清和細胞，反復凍融3次，提取核酸，熒光定量RT-PCR檢測PEDV在細胞中的病毒拷貝數，結果顯示PEDV感染后36 h和48 h 拷貝數顯著高于對照組(圖5)，說明Viperin能夠促進PEDV RNA合成。

圖5 過表達Viperin促進PEDV增殖Fig.5 Overexpression of Viperin promotes PEDV replication*：P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.005;下同*：P<0.05,**:P<0.01,***:P<0.005. The same as below

2.5 干擾Viperin基因表達抑制PEDV增殖 設計3對siRNA，轉染Vero E6細胞，分別于轉染后24 h收集細胞，提取核酸，熒光定量RT-PCR檢測細胞中Viperin的轉錄水平，結果顯示設計的3對siRNA均能干擾Viperin的表達(圖6A)。選取siViperin-2干擾Vero細胞中Viperin，隨后接毒進行PEDV拷貝數檢測，結果顯示：與對照組相比，干擾細胞中Viperin能顯著抑制PEDV RNA的合成(圖6B)。

圖6 干擾Viperin基因表達抑制PEDV增殖Fig.6 Interfering Viperin gene expression inhibits PEDV proliferationA：siRNA干擾Viperin轉錄效果檢測； B：siRNA干擾Viperin對PEDV增殖的影響A:Detection of Viperin transcriptional effect of siRNA interference; B:Effects of siRNA interference with Viperin on PEDV proliferation

2.6 Viperin各功能區過表達對PEDV增殖的影響 將重組質粒pWPXL-Viperin△C、pWPXL-Viperin△N、pWPXL-Viperin△SAM分別轉染Vero E6細胞，24 h后接種PEDV，接毒后24 h收取細胞和上清，提取核酸，熒光定量檢測PEDV拷貝數，結果如圖7所示，與對照相比，Viperin的C末端區域能夠顯著促進PEDV RNA的合成。

圖7 Viperin各功能區對PEDV增殖的影響Fig.7 Effects of Viperin functional regoins on PEDV proliferation

3 討論

干擾素(Interferon,IFN)是機體先天性免疫中重要的抗病毒因子，能夠誘導不同的ISGs表達發揮不同的抗病毒作用。Viperin作為ISGs，一方面可以抑制病毒的復制，發揮抗病毒作用。研究顯示：豬Viperin與豬瘟病毒E2和5A蛋白相互作用，抑制病毒增殖[10-11]；豬Viperin還可以抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒入侵和基因組的復制和轉錄[12]；羊Viperin能夠與山羊副流感病毒3型病毒N蛋白相互作用，抑制病毒增殖[13]；雞Viperin可能通過與新城疫病毒Matrix蛋白相互作用抑制病毒增殖[14]。Viperin抑制病毒復制機制是多樣的，A型流感病毒感染過程中，Viperin破壞脂筏的形成進而抑制病毒復制[15]。馬傳染性貧血病毒感染過程中，Viperin可以阻止病毒Gag蛋白的出芽，進而抑制病毒增殖，同時Viperin還可以破壞宿主細胞內質網結構，阻斷病毒囊膜的合成，同時Viperin還可以通過阻止馬傳染性貧血病毒受體蛋白ELR-1的表達，進而抑制馬傳染性貧血病毒侵入細胞[16]。

另一方面，Viperin又能促進病毒的增殖，對自身造成損害。研究表明，人Viperin通過與人巨細胞病毒的vMIA相互作用，抑制線粒體3功能蛋白功能，導致細胞骨架解聚，從而增強人巨細胞病毒的感染性[17-18]。本試驗結果顯示，Viperin的C末端能夠顯著促進PEDV RNA在Vero E6上的合成，豬Viperin是否有類似機制有待于進一步的研究。

本試驗成功構建了表達豬Viperin的各個功能區真核質粒，并探討了Viperin各個功能區對PEDV復制的影響，結果顯示過表達Viperin C末端顯著促進病毒RNA的合成。該試驗為進一步探索抗病毒蛋白調控PEDV增殖的機制提供了科學依據。