3種膠體金試紙條檢測羊布魯氏菌病效果的比較

李巧玲 ， 孫佳麗 ， 彭小薇 ， 馮 宇 ， 蔣 卉 ， 范學(xué)政 ， 朱良全 ， 丁家波 ， 董 浩 ， 秦玉明

(1. 中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 大興 102618 ； 2. 中國動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 ， 北京 大興 102600 ；3. 中國食品藥品檢定研究院 ， 北京 大興 102600)

布魯氏菌病(簡稱“布病”)是一種危害嚴(yán)重的人獸共患病，該病在全世界范圍流行。目前全世界已有170多個(gè)國家有人間或畜間布魯氏菌病的報(bào)道。家畜感染布魯氏菌病主要會(huì)引起流產(chǎn)和不育，而人感染布魯氏菌病則會(huì)引起波浪熱、盜汗、關(guān)節(jié)疼痛和肝脾腫大等癥狀，該病嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的發(fā)展和人類的公共衛(wèi)生[1]。

2000年以來，由于我國家畜飼養(yǎng)量的增長迅速和市場交易愈加頻繁等原因，我國人間和畜間的布魯氏菌病疫情都出現(xiàn)了反彈。根據(jù)中國疾病預(yù)防控制中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，2019年我國人間布病新增病例數(shù)比2018年增加了16%。2013—2017年，國家/OIE動(dòng)物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室對(duì)有流產(chǎn)癥狀的非免疫牛場采集的23 381份血清樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中布魯氏菌抗體平均個(gè)體陽性率高達(dá)44.2%[2]。

根據(jù)我國現(xiàn)行的動(dòng)物布魯氏菌病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18646—2018)，虎紅平板凝集試驗(yàn)常用于家畜布病田間篩選，采用試管凝集試驗(yàn)、競爭酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(cELISA)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等方法進(jìn)行確證。膠體金免疫層析法作為一種敏感性高、操作簡單的快速檢測方法，已被作為一種布魯氏菌病的初篩方法納入我國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《布魯氏菌病診斷》(WS 269—2019)。但是該方法尚未被收入我國動(dòng)物布魯氏菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)之中。同時(shí)，盡管早期已有相關(guān)研究將膠體金免疫層析法與其他種布魯氏菌診斷方法進(jìn)行了比較，卻沒有對(duì)不同品牌膠體金之間進(jìn)行比較的報(bào)道[3-6]。本試驗(yàn)分別對(duì)3種品牌的膠體金試紙條的敏感性、特異性、重復(fù)性進(jìn)行了比較，同時(shí)還使用3種品牌的膠體金試紙條、虎紅平板凝集試驗(yàn)和cELISA試驗(yàn)對(duì)臨床羊血清樣品進(jìn)行了檢測，較全面的對(duì)3種品牌的膠體金試紙條的檢測性能進(jìn)行了評(píng)估，以期為畜間布魯氏菌病的防控提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 血清樣品 147份羊血清采自內(nèi)蒙古自治區(qū)、遼寧省和河北省的非免疫羊群。羊布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清由國家/OIE動(dòng)物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室提供。小反芻獸疫免疫陽性血清、A型口蹄疫免疫陽性血清、O型口蹄疫免疫陽性血清和山羊痘疫苗免疫陽性血清由國家/OIE動(dòng)物布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑 布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原(批號(hào)：20200714)和布魯氏菌病cELISA試劑盒(批號(hào)：20061901)，均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；布氏桿菌抗體快速檢測卡(批號(hào)：201A050100K102)，購自深圳市易瑞生物技術(shù)股份有限公司，下文簡稱“易瑞膠體金”；牛羊布魯氏菌抗體一步法膠體金快速檢測卡(批號(hào)：G190705308)，購自上海快靈生物科技有限公司，下文簡稱“快靈膠體金”；布魯氏菌抗體金標(biāo)快速檢測卡(競爭法)(批號(hào)：BRU201101)，購自浙江迪恩生物科技股份有限公司，下文簡稱“迪恩膠體金”。

1.3 方法

1.3.1 敏感性比較 使用羊陰性血清將羊布魯氏菌病標(biāo)準(zhǔn)陽性血清依次稀釋至40、20、10、5 IU和2.5 IU，分別使用3種膠體金試紙條對(duì)上述稀釋的羊血清樣品進(jìn)行檢測，每個(gè)稀釋度的血清樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

按照我國動(dòng)物布魯氏菌病的診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18646—2018)進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)和cELISA試驗(yàn)。按照3種品牌膠體金試紙條說明書的相關(guān)要求對(duì)羊血清樣品進(jìn)行檢測。

1.3.2 特異性比較 分別使用3種膠體金試紙條對(duì)小反芻獸疫免疫陽性血清、A型口蹄疫免疫陽性血清、O型口蹄疫免疫陽性血清和山羊痘疫苗免疫陽性血清進(jìn)行檢測，比較三者的特異性。除此之外，使用55份cELISA檢測陰性的臨床陰性羊血清(國家/OIE布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室留存)對(duì)3種膠體金的特異性進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。

1.3.3 重復(fù)性比較 分別使用3種膠體金試紙條對(duì)3份布魯氏菌病陰性羊血清和3份布魯氏菌病陽性羊血清進(jìn)行5次重復(fù)檢測，比較三者的重復(fù)性。

1.3.4 臨床樣品檢測 分別使用3種膠體金試紙條、虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原和布魯氏菌病cELISA試劑盒對(duì)92份臨床羊血清進(jìn)行檢測。其中虎紅平板凝集試驗(yàn)和cELISA試驗(yàn)按照國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646—2018)的相關(guān)要求開展。

2 結(jié)果

2.1 3種膠體金試紙條敏感性的比較 使用3種膠體金試紙條和虎紅平板凝集抗原分別對(duì)效價(jià)40、20、10、5 IU和2.5 IU的羊血清樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測，以3次均為陽性的最低檢測效價(jià)為最低檢測限。結(jié)果如表1所示：使用易瑞膠體金進(jìn)行3次檢測的最低檢測限為5 IU；使用迪恩膠體金進(jìn)行3次檢測的最低檢測限為5 IU；使用快靈膠體金進(jìn)行3次檢測的最低檢測限為5 IU。3種膠體金試紙條的敏感性均高于虎紅平板凝集試驗(yàn)。

表1 3種膠體金試紙條和虎紅平板凝集抗原的敏感性比較Table 1 Comparative sensitivity of three colloidal gold test strips and Rose Bengal plate test

2.2 3種膠體金試紙條特異性的比較 對(duì)小反芻獸疫免疫陽性血清、A型口蹄疫免疫陽性血清、O型口蹄疫免疫陽性血清和山羊痘疫苗免疫陽性血清進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，3種膠體金試紙條對(duì)上述血清樣品均不發(fā)生交叉反應(yīng)；對(duì)55份臨床陰性羊血清(國家/OIE布魯氏菌病參考實(shí)驗(yàn)室留存)檢測結(jié)果也全部為陰性，說明3種膠體金試紙條都具有良好的特異性。

2.3 3種膠體金試紙條重復(fù)性的比較 重復(fù)性檢測結(jié)果顯示，3種膠體金試紙條在對(duì)3份已知陽性羊血清的檢測中均為陽性，對(duì)已知陰性羊血清的檢測均為陰性。

2.4 3種膠體金試紙條檢測臨床羊血清效果的比較 為了比較不同膠體金試紙條對(duì)臨床羊血清樣品的檢測效果，分別使用3種膠體金試紙條對(duì)92份臨床羊血清進(jìn)行檢測。檢測結(jié)果如表2所示，在3種膠體金試紙條中，易瑞膠體金檢出了64份陽性和28份陰性樣品；迪恩膠體金檢出了58份陽性和34份陰性樣品；快靈膠體金檢出了63份陽性和29份陰性樣品。

表2 不同檢測方法檢測臨床羊血清樣品的結(jié)果Table 2 Analysis of clinical sheep serum samples by different methods

虎紅平板凝集試驗(yàn)是目前我國應(yīng)用最為廣泛的動(dòng)物布魯氏菌病初篩方法，同時(shí)在《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646—2018)中，cELISA試驗(yàn)作為動(dòng)物布魯氏菌病血清學(xué)檢測的確診方法，因此同時(shí)采用了虎紅平板凝集試驗(yàn)和cELISA試驗(yàn)對(duì)上述臨床羊血清樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，虎紅平板凝集試驗(yàn)檢測出了44份陽性和48份陰性樣品；cELISA試驗(yàn)檢測出了61份陽性和31份陰性樣品。

為了進(jìn)一步確定不同膠體金試紙條的檢測效果，分別計(jì)算了3種膠體金試紙條與cELISA試驗(yàn)檢測結(jié)果的符合率。結(jié)果表明，易瑞膠體金與cELISA試驗(yàn)的陽性符合率為90.16%，陰性符合率為70.97%，總符合率為83.70%；迪恩膠體金與cELISA試驗(yàn)的陽性符合率為91.80%，陰性符合率為93.55%，總符合率為93.48%；快靈膠體金與cELISA試驗(yàn)的陽性符合率為91.80%，陰性符合率為77.42%，總符合率為86.96%；虎紅平板凝集試驗(yàn)與cELISA試驗(yàn)的陽性符合率為68.85%，陰性符合率為93.55%，總符合率為77.17%(表3)。

表3 3種膠體金試紙條與cELISA的符合率Table 3 Coincidence rates of three colloidal gold test strips and cELISA (%)

3 討論

在動(dòng)物布魯氏菌病的檢測方法中，血清學(xué)檢測方法在獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)該最為廣泛。根據(jù)現(xiàn)行的動(dòng)物布魯氏菌病檢測國家標(biāo)準(zhǔn)《動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)》(GB/T18646—2018)，布魯氏菌病的血清學(xué)檢測方法主要有虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、乳環(huán)試驗(yàn)、間接ELISA試驗(yàn)、cELISA試驗(yàn)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)等，而膠體金免疫層析法作為一種新型的檢測方法，目前尚未收錄于任何一種動(dòng)物布魯氏菌病檢測的標(biāo)準(zhǔn)中。

目前，已有部分研究探討了膠體金免疫層析法對(duì)動(dòng)物布魯氏菌病的檢測效果。董浩等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，使用膠體金試紙條檢測羊血清樣品比虎紅平板凝集試驗(yàn)多檢出了22.86%的經(jīng)試管凝集試驗(yàn)確診的陽性樣品，由此可見，使用膠體金免疫層析法對(duì)羊血清進(jìn)行檢測時(shí)可以有效降低漏檢的可能性。這一數(shù)據(jù)與本試驗(yàn)中3種膠體金試紙條敏感性均明顯高于虎紅平板凝集試驗(yàn)的結(jié)果相吻合。

李峰等[8]采用虎紅平板凝集試驗(yàn)、膠體金試紙條、試管凝集試驗(yàn)和cELISA對(duì)某地區(qū)的羊布魯氏菌病血清樣品的檢測結(jié)果顯示，虎紅平板凝集試驗(yàn)和膠體金免疫層析法與cELISA的符合率分別為97.0%和98.3%。歐建偉等[9]采用虎紅平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、間接ELISA、cELISA和膠體金法對(duì)牛羊血清樣品進(jìn)行布魯氏菌病抗體檢測，發(fā)現(xiàn)檢測羊血清時(shí)虎紅平板凝集試驗(yàn)和膠體金免疫層析法與試管凝集試驗(yàn)的符合率分別為97.78%和100%。上述文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果說明，膠體金免疫層析法的檢測效果并沒有明顯優(yōu)于虎紅平板凝集試驗(yàn)，筆者分析這與上述試驗(yàn)與本試驗(yàn)采用方法比對(duì)的樣品盤不同密切相關(guān)。在本試驗(yàn)中，樣品盤中的血清樣品中陽性樣品數(shù)量和陰性樣品數(shù)量基本相當(dāng)，且存在大量的弱陽性樣品，更利于評(píng)估不同方法間檢測效果的差別。

與以往比較不同類型布魯氏菌病檢測方法的研究不同，本試驗(yàn)首次對(duì)不同品牌的膠體金試紙條的檢測效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明3種膠體金試紙條的敏感性、特異性和重復(fù)性都比較理想，并且在臨床羊血清樣品檢測過程中，3種膠體金試紙條與cELISA的符合率也均高于虎紅平板凝集試驗(yàn)與cELISA的符合率，可見膠體金免疫層析法是一種比較可靠的羊布魯氏菌病檢測方法。因此，建議相關(guān)部門盡快將該方法納入動(dòng)物布魯氏菌病診斷的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，以提高我國獸醫(yī)試驗(yàn)的檢測能力，促進(jìn)家畜布魯氏菌病的防控。