基于重組外膜蛋白研制檢測副雞禽桿菌抗體金標試紙

梅 晨 ， 胡 偉 ， 張 雪 ， 王宏俊

(北京市農(nóng)林科學院畜牧獸醫(yī)研究所 畜禽疫病防控技術(shù)北京市重點實驗室 ， 北京 海淀 100097)

副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum,Apg)可以引起雞發(fā)生傳染性鼻炎(Infectious coryza,IC)，該病可使蛋雞產(chǎn)蛋量下降10%～40%，導(dǎo)致育成雞正常生長發(fā)育受到阻滯并引發(fā)淘汰率增加[1]。肉雞發(fā)生該病引起肉品質(zhì)下降，胴體淘汰率增加[2-3]。如今集約化養(yǎng)殖發(fā)展快速，該病的發(fā)生和流行逐年上升，給養(yǎng)禽業(yè)帶來了較嚴重的損失。目前，國內(nèi)外常用全菌滅活疫苗預(yù)防該病，但如何快速準確地檢測副雞禽桿菌抗體、監(jiān)測疫苗的免疫效果，是實際工作中亟需解決的問題。

血清學診斷技術(shù)是一項簡便、快速、安全和經(jīng)濟的診斷方法，其中平板凝集試驗[4]、血凝抑制試驗(HI)[5]和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)[6]等方法在現(xiàn)行的雞傳染性鼻炎防控中廣泛應(yīng)用，HI和ELISA方法已成為雞傳染性鼻炎診斷技術(shù)的行業(yè)標準[7]。然而，這些血清學診斷方法主要基于全菌蛋白等菌體來源的天然抗原，存在抗體效價與免疫保護率相關(guān)性不強的問題[8-9]，且檢測步驟復(fù)雜，時間周期也較長。有報道指出，副雞禽桿菌外膜蛋白HMTp210具有較好的免疫原性，可以作為亞單位疫苗的候選抗原[10]。并且，該蛋白作為診斷抗原所建立的ELISA檢測方法具有較好的特異性和較高的靈敏度[10]。本試驗以原核表達HMTp210部分蛋白P9[11]成分作為檢測抗原，研制了一種副雞禽桿菌抗體金標檢測試紙條。

1 材料與方法

1.1 主要原輔材料 氯金酸、NC膜、樣品墊、吸水濾紙及PVC板，均購自北京吉森生物科技有限公司。二喹啉甲酸 (bicinchoninic acid，BCA)法蛋白測定試劑盒，購自北京康為世紀生物科技有限公司。重組副雞禽桿菌外膜蛋白(P9蛋白)由本實驗室制備并純化[11]。兔抗雞IgG 蛋白由本實驗室采用SPF雞血清免疫雄性健康家兔后采血制備并純化。羊抗兔IgG蛋白由本實驗室采用健康家兔血清免疫山羊后采血制備并純化。副雞禽桿菌標準陽性對照血清為副雞禽桿菌滅活疫苗(鼻多寶，信得科技，批號：201905001)免疫雞血清，副雞禽桿菌陰性對照血清為SPF雞血清。雞新城疫病毒陽性血清、禽流感病毒陽性血清、雞支原體陽性血清、雞大腸埃希菌陽性血清，由章振華研究員惠贈。

1.2 膠體金標記兔抗雞IgG制備 通過心臟無菌采集SPF雞血，37 ℃溫箱放置30 min，在4 ℃冰箱中靜置2 h，置于離心機中5 000 r/min離心10 min，收集約20 mL血清。辛酸-硫酸銨法純化雞血清IgG蛋白：首先血清水平離心5 000 r/min 約10 min，加入4倍體積醋酸鈉溶液與離心后的上清部分混合均勻，加入0.1 mol/L 的NaOH溶液調(diào)整收集上清至pH 4.5左右。將25 μL辛酸滴加在每毫升混合液中，同時攪拌，置于4 ℃冰箱2 h后，水平離心8 000 r/min 約30 min，收集混合液的上清部分并進行過濾，調(diào)節(jié)至pH 7.4左右，加入0.277 g的硫酸銨與每毫升混合液混勻，攪拌30 min。混合液離心10 000 r/min 約15 min后收集混合液沉淀部分，過夜透析沉淀，得到粗提的IgG。雞IgG濃縮步驟：裝有IgG的透析袋用聚乙二醇包埋并透析2 h。BCA蛋白定量法測定蛋白含量為11.5 mg/mL，-20 ℃保存?zhèn)溆肹12]。將雞IgG與弗氏完全佐劑按1∶1體積比乳化后，接種4只雄性健康家兔頸部及背部皮下，每間隔10 d免疫1次，每次免疫0.5 mL，共免疫4次。免疫后通過心臟無菌采集兔血，分離血清后用辛酸-硫酸銨法純化兔抗雞IgG，方法同上。BCA蛋白定量法測定兔抗雞IgG含量為15.5 mg/mL。用氯金酸制備濃度為0.01%的膠體金35 mL左右，用0.25 mol/L K2CO3調(diào)整膠體金溶液至pH 8.2左右，再加入兔抗雞IgG約300 μg，勻速攪拌約20 min；再加入10% BSA 1.5 mL，均勻攪拌10 min；加入0.075 mL 20% PEG2000，均勻攪拌10 min；將標記好兔抗雞IgG的膠體金顆粒于4 ℃冰箱靜置1 h后放入50 mL離心管中，10 000 r/min水平離心35 min，垂直放置大約30 min后棄掉上清液，只留下濃縮標記好的膠體金顆粒備用。用0.2 mol/L PBS (pH 7.4)等量混勻標記好兔抗雞IgG的膠體金顆粒，再加入0.5 g BSA定容至3 mL，混勻后置于4 ℃保存?zhèn)溆肹13]。

1.3 羊抗兔IgG制備 按照無菌操作規(guī)范，通過心臟采集雄性健康家兔血，收集兔血清，IgG純化方法同1.2，BCA蛋白定量法測定兔IgG含量為14.8 mg/mL。將弗氏完全佐劑與兔IgG按1∶1體積比乳化后，免疫1只雄性健康山羊的頸部皮膚及背部皮膚皮下多點注射乳化蛋白，每間隔10 d進行1次免疫劑量為1 mL的免疫，共進行3次免疫。第3次免疫后的第10天用無菌法采集羊的心臟血備用。用辛酸-硫酸銨法純化羊抗兔IgG，純化方法同1.2，-20 ℃保存?zhèn)溆肹14]。

1.4 免疫層析檢測試紙條的制備 將副雞禽桿菌外膜蛋白P9和羊抗兔IgG蛋白用PBS溶液依次稀釋成0.005、0.01、0.015 mg/mL和0.02 mg/mL。在PVC底板上粘貼好NC膜，再將稀釋好的P9蛋白、羊抗兔IgG按順序先后噴涂在NC膜，標為T線和C線，將試紙條置于37 ℃的溫箱進行烘干。根據(jù)T線和C線顏色深度不隨濃度增加而加深時，確定為最佳的噴涂濃度。再在玻璃纖維膜上用噴膜儀將標記好兔抗雞IgG的膠體金溶液噴在對應(yīng)位置，37 ℃溫箱烘干，用劃膜儀在NC膜上將0.01 mg/mL副雞禽桿菌外膜蛋白P9和0.01 mg/mL的羊抗兔IgG蛋白分別噴涂，為試紙條的T線和C線，兩線間距約0.5 cm左右，靜置于37 ℃溫箱內(nèi)干燥2 h。將制備的樣品墊、兔抗雞IgG膠體金結(jié)合墊、NC膜和吸水墊按順序粘貼在PVC板上，切成約0.4 cm條狀，即為檢測副雞禽桿菌抗體的膠體金免疫層析試紙。將試紙裝入鋁箔袋中，加入干燥劑密封，4 ℃保存。

1.5 特異性試驗 制備好的試紙條同時檢測稀釋100倍的雞新城疫病毒的陽性血清、雞支原體陽性血清、禽流感病毒陽性血清、雞大腸埃希菌陽性血清。SPF雞陰性血清作為陰性對照，副雞禽桿菌滅活疫苗標準免疫血清作為陽性對照，觀察幾種樣品的反應(yīng)結(jié)果，判斷所制備試紙條的特異性。檢測方法：取10 μL血清或全血加入1 mL PBS中吹打混勻，吸取200 μL待檢樣品加入檢測卡樣品孔中(S孔)，靜置，在15 min 內(nèi)進行判讀。陽性結(jié)果：C線與T線都有紅色條帶；陰性結(jié)果：C線有紅色條帶，T線無條帶；無效結(jié)果：C線與T線均無條帶。

1.6 靈敏性試驗 用上述制備好的試紙條檢測副雞禽桿菌滅活疫苗標準免疫血清(按1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀釋)，同時以標準陽性血清(未稀釋)為陽性對照，出現(xiàn)陽性結(jié)果的血清最高稀釋度即為試紙條的敏感度。檢測方法同1.5。

1.7 穩(wěn)定性試驗 將上述制備好的試紙條與干燥劑一同裝入鋁箔袋中，密封保存于4 ℃冰箱，每隔7 d用PBS將副雞禽桿菌亞單位疫苗標準陽性血清稀釋100倍進行檢測，共檢測至28 d，檢測方法同1.5。

1.8 臨床樣品檢測 使用同一批次制備的試紙條對雞傳染性鼻炎三價滅活疫苗免疫后的200份雞血清樣品進行檢測，10 min后記錄結(jié)果，檢測方法同1.5。

1.9 與ELISA方法的比對 本實驗室用副雞禽桿菌外膜蛋白P9建立的間接ELISA方法[11]可以檢測副雞禽桿菌免疫或感染產(chǎn)生的抗體。采用ELISA方法與試紙條方法同時檢測免疫血清200份，SPF雞陰性血清20份，血清均按1∶100比例進行稀釋，統(tǒng)計試紙條法與ELISA法檢測結(jié)果是否一致。

2 結(jié)果

2.1 試紙條特異性 如圖1所示，本試驗制備的試紙條檢測雞新城疫病毒、禽流感病毒、雞支原體、雞大腸埃希菌等的單因子血清均無可見條帶，說明該試紙條特異性較好。

圖1 試紙條特異性Fig.1 Strip specificity test從左至右：樣品依次為雞新城疫病毒陽性血清(ND)、禽流感病毒陽性血清(AI)、雞支原體陽性血清(MG)、雞大腸埃希菌陽性血清(E.coli)、SPF雞血清(SPF)和副雞禽桿菌陽性血清(Apg)From left to right: Samples were Newcastle disease virus positive serum(ND), Avian influenza virus positive serum(AI), Mycoplasma gallisepticum positive serum(MG), Escherichia coli positive serum(E.coli), SPF chicken serum(SPF) and Avian paragallinarum positive serum(Apg), respectively

2.2 試紙條靈敏性 如圖2所示，本試驗制備的試紙條檢測不同稀釋倍數(shù)的副雞禽桿菌免疫血清，當稀釋度為1∶1 000時檢測線仍可見，表明該檢測試紙條靈敏性良好，為保證檢測的準確性，試紙條檢測時樣品稀釋定為1∶100倍。

圖2 試紙條靈敏性Fig.2 Strip sensitivity test從左至右：樣品依次為副雞禽桿菌高免血清稀釋10、100、1 000倍和10 000倍以及標準陽性血清(對照)From left to right：Samples were Avibacterium paragallinarum hyperimmune serum diluted 10,100,1 000,10 000 times and standard positive serum(Control),respectively

2.3 試紙條穩(wěn)定性 如圖3所示，本試驗制備的試紙條在4 ℃冰箱存放28 d，仍可以檢測出標準陽性血清，說明該試紙條靈敏度及穩(wěn)定性良好。

圖3 試紙條穩(wěn)定性Fig.3 Strip stability test從左至右：樣品依次為試紙條放置7、14、21 d和28 d檢測標準陽性血清(+)、陰性血清(-)(各1∶100倍稀釋)From left to right:Samples were positive serum(+) and negative serum(-) (diluted 1∶100 times for each) detected after the strip was placed on 7,14,21 d and 28 d

2.4 臨床樣品檢測 在200份免疫血清樣品中，試紙條檢測顯示陽性結(jié)果的樣品為196份，陰性結(jié)果的樣品為4份，本試驗制備的試紙條檢測的符合率為98%。

2.5 與ELISA方法的比對 采用ELISA方法檢測同一批雞血清臨床樣品，結(jié)果全部為陽性。鑒于該批血清由試紙條法檢測的陽性檢出率是98%，可以算出以上2種檢測方法的陽性符合率高達99%；用試紙條法和ELISA法檢測SPF雞陰性血清20份，結(jié)果顯示試紙條法及ELISA法檢測均為陰性，陰性符合率100%，結(jié)合陽性符合率，總符合率是99.5%。

3 討論

膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀末發(fā)展起來的一種新型體外診斷技術(shù)，其優(yōu)點為：操作簡便、檢測迅速、特異性強，成為快速檢測藥物殘留、抗體和激素水平等的首選。膠體金標記由于標記物制備簡便，方法敏感、特異，不需要任何輔助儀器和試劑，且操作人員不用進行技術(shù)培訓(xùn)，方便于廣大基層檢驗人員，檢測結(jié)果判斷清楚直觀，用時短，可對大批量樣品進行現(xiàn)場檢測和大面積普查[15]。

本試紙條所用檢測蛋白P9源自副雞禽桿菌外膜蛋白HMTp210。該蛋白含有副雞禽桿菌重要的保護性抗原[16]。Sakamoto等融合表達了不同血清型的HMTp210的高變區(qū)，用動物試驗證明了該融合蛋白能夠產(chǎn)生與全細菌滅活疫苗相似的保護水平[10]。該蛋白是亞單位疫苗的候選抗原成分，也是建立有效抗體檢測方法的候選蛋白。本試驗在已建立的ELISA方法[11]的基礎(chǔ)上，用P9蛋白作為檢測抗原，建立了一種間接免疫層析金標試紙條，該試紙條具有很高的特異性、靈敏度及穩(wěn)定性，對陽性樣品檢測靈敏度可達1∶1 000，對疫苗免疫血清樣品檢測符合率為100%，放置28 d后仍可檢測出稀釋后的陽性血清。與間接ELISA法相比，試紙條法的敏感性稍弱，抗體水平較低的樣品可能會出現(xiàn)陰性結(jié)果[17]。但試紙條的優(yōu)點在于不需要專門的儀器設(shè)備，適用于田間現(xiàn)場快速檢測，也可同時檢測大量血清樣本，可以作為免疫效果監(jiān)測、疾病診斷等的技術(shù)手段[18-19]。本試驗構(gòu)建的副雞禽桿菌抗體檢測膠體金試紙是對HI[20]、ELISA等抗體檢測方法的有益補充。

綜上，基于重組外膜蛋白的副雞禽桿菌抗體金標檢測試紙具備較高的檢測靈敏度和較好的特異性，結(jié)合其快速簡便等操作特點，是一種較理想的副雞禽桿菌抗體檢測試劑。