防污染PCR檢測食源性沙門菌方法的建立

黃名英 ， 傅安靜 ， 王遠微

(1. 成都農業科技職業學院 ， 四川 成都 611130 ； 2. 西南民族大學畜牧獸醫學院， 四川 成都 610041)

沙門菌(Salmonella)是一種可導致人獸共患病的腸道菌科細菌，為兩端鈍圓的革蘭陰性菌，兼性厭氧[1]，無芽孢，一般無莢膜，除雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌外，其他都有周身鞭毛。在世界食源性病原菌引起的食物中毒事件中，沙門菌經常位列榜首[2]。沙門菌在自然界中廣泛存在，種類繁多，目前已檢測出的沙門菌血清型有2 500余種，我國已報道的有292種血清型[3]。沙門菌營養要求低，繁殖快，在常溫條件下即可繁殖，以肉類食品為主要污染對象，也可污染禽類、蛋類等食品[4-5]。傳統方法檢測沙門菌時間長，工作量大，特異性和靈敏度也不高[6]，因此，如何快速準確檢測出沙門菌對于食物中毒的防控極為重要。隨著分子生物學技術的發展，沙門菌的檢測方法也出現了聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)法[7-8]、實時熒光PCR法[9]、環介導等溫擴增法(LAMP)[10]等。

PCR是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制，具有特異性強、靈敏度高、簡便快速等特點，被廣泛應用于食品檢測中。但PCR技術過高的靈敏度導致其極易污染，產生假陽性結果，嚴重干擾PCR檢測的準確性。而且隨著技術不斷發展，實時熒光PCR法和環介導等溫擴增法等檢測方法的靈敏度越來越高，造成污染的風險也越來越高。造成PCR污染的主要污染源是擴增產物和陽性對照物。由于拷貝數量極大，在PCR擴增時的開蓋、搖動、吸樣過程中與空氣接觸形成氣溶膠體，對空氣、試劑、移液器以及操作人員的手套衣物造成污染[11]，反復造成陰性對照出現假陽性，導致檢測無法正常順利進行。為了防止PCR污染，很多技術方法被應用，主要有物理隔絕法、紫外照射法、水解法、化學修飾法和DEAE纖維素法等，但是這些方法費時費力，而且效果不理想。尿嘧啶糖基化酶(Uracil-N-glycosylase，UNG)是一種DNA修復酶，在適宜條件下能特異地識別并切割DNA分子中出現的尿嘧啶核苷。利用該酶的這種特性建立的防污染方法在一些病原檢測中得到了應用，有效地消除了污染[12]，但還未見該方法應用于食源性沙門菌的檢測。

本試驗基于UNG的生物學特性，用dUTP代替dTTP對沙門菌基因組DNA進行擴增，得到大量含有尿嘧啶的U-DNA作為檢測陽性模板，在PCR反應體系中引入UNG和UNG抑制劑(UGI)，對反應條件進行優化，最終建立防污染的沙門菌PCR檢測方法。該方法對實驗室環境要求以及操作人員的操作要求不嚴格，對于PCR反應的反應性、便捷性和時效性無影響，也不影響后續試驗，同時可以解決陽性對照物以及擴增產物對PCR擴增體系污染的問題，降低假陽性的出現，提高檢測方法的可靠性。同時，為建立基于UNG的防污染實時熒光PCR方法、LAMP方法等提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 鼠傷寒沙門菌CICC22956、單增李斯特桿菌CICC 21633，購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)；金黃色葡萄球菌、志賀氏大腸桿菌、空腸彎曲菌、鏈球菌、變形桿菌、綠膿桿菌等，均由西南民族大學動物醫學實驗室分離保存。UNG、TaKaRaTaqTM酶，均購自寶生物工程(大連)有限公司;UNG抑制劑(UGI)，購自美國NEB公司；dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dUTP)，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自美國Sigma公司；營養肉湯、選擇培養基，均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 儀器與設備 PCR擴增儀，美國ABI公司；高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；電熱恒溫水浴箱，上海精宏實驗設備有限公司；電泳儀、凝膠成像系統，美國Biorad公司；核酸定量儀，美國Thermo Scientific公司；恒溫培養箱，美國 Thermo Scientific公司；微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 沙門菌的培養與DNA提取 把沙門菌菌株用平板劃線法接種到營養肉湯上，在37 ℃恒溫培養箱中培養24 h，然后取菌液接種到沙門菌選擇培養基中，37 ℃下恒溫培養24 h，傳代培養2次，挑取單菌落擴繁，備用。

取沙門菌純培養液經離心沉淀后，將得到的菌體沉淀按DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA，備用。

1.3.2 PCR方法的建立 根據GenBank中公布的沙門菌invA基因的序列，通過序列比對，找到保守序列，利用Primer Premier 7.0軟件設計了1對引物。將設計的引物通過NCBI網站的BLAST工具進行檢索，驗證了其特異性。引物序列invA-F:ATTGGCGATAGCCTGGCGGTGG;invA-R:TCGCACCGTCAAAGGAACCGTA,擴增的目的片段大小為250 bp。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR反應按照TaKaRaTaqTM酶推薦的反應體系：DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL(10 pmol)，4×dNTPs(10 mmol/L) 2 μL，Taq酶(5 U/μL) 0.1 μL,Mg2+1.5 μL(25 mol/mL)，10×PCR Buffer 2 μL，用超純水補足至20 μL。

以上述PCR反應體系進行梯度PCR，優化退火溫度，擴增程序:95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s,50～60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30個循環；72 ℃溫浴10 min。降至室溫后使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.3 UNG防污染PCR反應體系的建立 將1.3.2中PCR反應體系中的dNTPs替換為用3倍濃度dUTP取代dTTP的dNTPs，同時相應的提高Mg2+的用量到2 μL，按照新的反應體系和優化好的退火溫度，進行目的片段的PCR擴增。

1.3.4 UNG用量的優化 按照1.3.3所述反應體系和反應條件，1 μL的模板DNA的體系中分別加入1、1.5、2U和2.5U UNG，并設置無UNG對照，25 ℃下作用10 min，然后進行PCR反應，取5 μL產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳并在凝膠成像系統中觀察分析電泳結果，確定模板完全降解時的最小酶用量，即為最適酶用量。

1.3.5 UNG反應時間的優化 按照1.3.3所述反應體系和反應條件，1 μL的模板DNA體系中根據1.3.4所得最適用量加入UNG，并設置無UNG對照，25 ℃下分別作用5、10、15 min和20 min，然后進行PCR反應，觀察分析電泳結果，確定DNA模板完全降解時的最短反應時間。

1.3.6 UGI用量的優化 按照1.3.3所述反應體系和反應條件，1 μL的模板DNA體系中根據1.3.4所得加入UNG后，分別加入1、1.5、2U和2.5U酶抑制劑UGI，并設置無UNG對照和無UGI對照，先在50 ℃下作用20 min，再在25 ℃下作用1.3.5中優化的時間，然后進行PCR反應，觀察分析產物電泳結果，確定UNG完全失去降解作用時的UGI用量，即為UGI最適用量。

1.3.7 UGI反應時間的優化 按照1.3.3所述反應體系和反應條件，根據1.3.4以及1.3.6所得，在1 μL模板DNA體系中加入UNG和UGI，并設置無UNG對照和無UGI對照，分別在50 ℃下作用5、10、15 min和20 min后，在25 ℃下作用1.3.5中優化的時間，然后進行PCR反應，觀察分析電泳結果，確定UNG完全失去降解作用時的最短反應時間。

1.3.8 防污染效果驗證 按照1.3.3所述反應條件，根據上述反應條件優化試驗所得，在分別含有0.1、0.2、0.5、1 μg和2 μg陽性模板的PCR反應體系中，對照組不加UNG和UGI，A組中加入最適用量的UNG，B組加入最適用量的UNG和UGI，先在50 ℃條件下作用1.3.7中優化的時間，再在25 ℃條件下作用1.3.5中優化的時間，然后進行PCR擴增，觀察電泳結果。

1.3.9 特異性檢測 用優化好的防污染反應體系及反應條件分別對鼠傷寒沙門菌、單增李斯特桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏大腸桿菌、鏈球菌、變形桿菌和綠膿桿菌樣本進行檢測，驗證特異性。同時用未加UNG和UGI的反應體系和反應條件對上述樣本進行檢測，驗證防污染體系對PCR方法特異性是否有影響。

1.3.10 敏感性檢測 將已知濃度的陽性標準品進行10倍梯度稀釋(101～1010)后作為模板，采用優化好的防污染PCR進行擴增，同時用未加UNG和UGI的PCR進行擴增，PCR產物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，檢驗靈敏度，同時驗證防污染體系對PCR方法敏感性是否有影響。

2 結果

2.1 防污染PCR擴增體系和擴增條件 最終確定防污染PCR擴增體系：DNA 模板1 μL，上下游引物各1 μL(10 pmol)，4×dNTPs(dUTP) 2 μL，Taq酶(5U/μL) 0.1 μL,Mg2+2 μL(25 mol/mL)，10×PCR Buffer 2 μL，用超純水補足至20 μL。擴增條件：95 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個循環；再72 ℃溫浴10 min。

2.2 含dUTP的目的DNA片段擴增 取沙門菌DNA作為模板，按照1.3.2中的方法配制成20 μL的反應體系進行PCR擴增，并對擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果，如圖1所示，擴增后得到的產物片段大小為250 bp左右，條帶清晰明亮。保留電泳結果為陽性的擴增產物為最后續試驗的陽性模板。

圖1 目的DNA片段PCR擴增Fig.1 PCR amplification of target DNA fragmentM:Marker； N:陰性對照； 1～4:陽性模板M:Marker； N:Negative control； 1-4:Positive template

2.3 UNG用量的優化 取1 μL模板DNA進行UNG用量的優化，擴增后觀察擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果，如圖2所示，經UNG作用后，擴增產物電泳條帶變得模糊，清晰度變差，當UNG用量為1.5U時條帶完全消失，即在25 ℃條件下作用10 min后，1.5U UNG可以將所有模板完全降解掉，UNG最適用量為1.5U。

圖2 UNG用量的優化Fig.2 Optimization of UNG quantityM:Marker； 1:無UNG對照； 2:0.5U UNG； 3:1U UNG； 4:1.5U UNG； 5:2U UNG； 6:2.5U UNGM:Marker； 1:Without UNG control； 2:0.5U UNG； 3:1U UNG； 4:1.5U UNG； 5:2U UNG； 6:2.5U UNG

2.4 UNG反應時間的優化 在得出UNG最適用量的條件下，改變UNG作用時間，對UNG最適作用時間進行探索，結果如圖3所示，隨著作用時間的增加，UNG的降解能力增強，1 μg的模板DNA，加入1.5U UNG后，在25 ℃條件下作用15 min后，可以將所有模板完全降解掉，即UNG最適作用時間為15 min。

圖3 UNG反應時間的優化Fig.3 Optimization of UNG reaction timeM:Marker; 1:無UNG酶對照; 2:5 min; 3:10 min; 4:15 min; 5:20 minM:Marker; 1:Without UNG control; 2:5 min; 3:10 min; 4:15 min; 5:20 min

2.5 UGI用量的優化 在得出UNG最適用量和最適反應時間的條件下，引入UGI，進行UGI用量的優化。結果如圖4所示，UGI能夠抑制UNG的作用，即隨著UGI用量增加，UNG的降解作用減弱，條帶的亮度增大。1 μg模板DNA，加入1.5U UNG和2U UGI后，先在50 ℃條件下作用20 min，然后再在25 ℃條件下作用15 min，可以完全使UNG失去降解作用。產物的電泳結果條帶與無UNG時相同，即UGI最適用量為2U。

圖4 UGI用量的優化Fig.4 Optimization of UGI quantityM:Marker; 1:無UNG對照; 2:無UGI對照; 3:1U UGI; 4:1.5U UGI; 5:2U UGI； 6:2.5U UGIM:Marker; 1:Without UNG control; 2:Without UGI control; 3:1U UGI; 4:1.5U UGI; 5:2U UGI; 6:2.5U UGI

2.6 UGI反應時間的優化 改變UGI反應時間，控制其他條件不變，對UGI反應時間進行優化。結果如圖5所示，1 μg模板DNA，加入1.5U UNG和2U UGI后，先在50 ℃條件下作用10 min，然后再在25 ℃條件下作用15 min，可以完全使UNG失去降解作用，即UGI最適反應時間為15 min。

圖5 UGI反應時間的優化Fig.5 Optimization of UGI reaction timeM:Marker; 1:無UNG對照; 2:無UGI對照; 3:5 min; 4:10 min; 5:15 min； 6:20 minM:Marker; 1:Without UNG control; 2:Without UGI control; 3:5 min; 4:10 min; 5:15 min; 6:20 min

2.7 結果驗證 在含有0.1、0.2、0.5、1.0 μg和2.0 μg陽性模板的PCR反應體系中，對照組不加UNG和UGI，A組中加入1.5U UNG，B組加入1.5U UNG和2U UGI，先在50 ℃條件下作用10 min，再在25 ℃條件下作用15 min，然后進行PCR擴增，結果見表1，對照組所有濃度模板都有擴增，而且產物的量為“++++”，B組與對照組相同，A組在模板量為0.1、0.2 μg和0.5 μg的反應管為陰性，模板量為1.0 μg的反應管有微弱條帶，條帶亮度為“+”，模板量為2.0 μg的反應管條帶亮度為“++”，表明UNG可以有效防止污染，雖然模板量為1.0 μg和2.0 μg的反應管有少量擴增，但是實際進行試驗操作的時候很少能污染那么大量的陽性模板。UGI可以完全抑制UNG的作用，不影響產物的擴增。

表1 防污染效果驗證結果Table 1 Verification of contaminant-preventing effects

2.8 特異性檢測 特異性檢測結果如圖6所示，無論是防污染體系的PCR方法還是無UNG和UGI的PCR方法只能從鼠傷寒沙門菌陽性樣本中檢出相應的特異性條帶，而對單增李斯特桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏大腸桿菌、鏈球菌、變形桿菌、綠膿桿菌均沒有擴增出條帶，表明本試驗所建立的PCR方法具有良好的特異性，而且加入UNG和UGI的防污染反應體系對PCR方法的特異性無影響。

圖6 特異性檢測Fig.6 Specificity testM:Marker; 1:鼠傷寒沙門菌; 2～7:分別為單增李斯特桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏大腸桿菌、鏈球菌、變形桿菌和綠膿桿菌; 8:鼠傷寒沙門菌(無UNG和UGI的擴增體系)； 9～14:分別為單增李斯特桿菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏大腸桿菌、鏈球菌、變形桿菌和綠膿桿菌(無UNG和UGI的擴增體系)M:Marker; 1:Salmonella typhimurium; 2-7:Listeria monocytogenes,Staphylococcus aureus,Shiga’s Escherichia coli,Streptococcus,Proteus and Pseudomonas aeruginosa,respectively; 8:Salmonella typhimurium(Amplification system without UNG and UGI)；9-14:Listeria monocytogenes,Staphylococcus aureus,Shiga’s Escherichia coli,Streptococcus,Proteus andPseudomonas aeruginosa,respectively (Amplification system without UNG and UGI)

2.9 敏感性檢測 敏感性檢測結果如圖7所示，無論是防污染體系的PCR方法還是無UNG和UGI的PCR方法對鼠傷寒沙門菌的核酸最低檢測限均為2.1×104copies/μL，具有較高的敏感度，而且加入UNG和UGI的防污染反應體系對PCR方法的敏感性無影響。

圖7 敏感性檢測Fig.7 Sensitivity testM:Marker; 1～6:分別為2.1×108 copies/μL至2.1×103 copies/μL的標準品; 8～12:分別為2.1×108 copies/μL至2.1×103 copies/μL的標準品(無UNG和UGI的擴增體系)M:Marker; 1-6:Standard substance from 2.1×108 copies/μL to 2.1×103 copies/μL,respectively; 8-12:Standard substance from 2.1×108 copies/μL to 2.1×103 copies/μL,respectively(Amplification system without UNG and UGI)

3 討論

沙門菌是一種常見的人獸共患病原菌，在我國每年都會發生由沙門菌引起的食物中毒事件，如何快速準確地檢測出沙門菌變得極其重要。PCR技術被廣泛應用于沙門菌的檢測中，但由于其自身特點而容易出現污染，為了解決這一難題，國內外的研究者提出了多種防污染技術，比如已經在目前的PCR試驗中得到普遍應用的物理隔絕法、紫外照射法、水解法等。物理隔絕法主要通過對實驗室操作平臺進行嚴格分區，以防止試劑、樣本及之間的交叉污染。紫外照射法操作較簡單且成本低。近年來又發現了防污染效果更好的化學修飾法、DEAE纖維素法、酶消化法等。異補骨脂素法屬于化學修飾法的一種，Cimino 等[13]將異補骨脂素在PCR前加入反應體系中，經過擴增后，再用UV照射15 min，結果發現異補骨脂素能夠有效消除長度為500 bp以上的片段，但濃度100 mg/mL的異補骨脂素會降低PCR的效率[14]。Glushkov等[15]發現DEAE法最高能將污染降低106倍，但是此方法操作過程較為繁瑣。

UNG法是酶消化法的一種，是利用UNG識別去除DNA中的尿嘧啶，把試劑中的dNTP全部替換為dUTP，擴增產物中的尿嘧啶被UNG消化后，在高溫下斷裂，而模板不含尿嘧啶所以不會受影響[16]。研究者在1974年發現UNG法，并純化研究[17-19]，至今被廣泛應用于PCR防污染中。Longo等[16]驗證了UNG法可以消除1010拷貝以上的 PCR 檢測產物，且消化時間僅需10 min。Rios-Sarabia等[20]和Hwang等[21]在麻風分歧桿菌、HIV、萊姆病、衣原體PCR 檢測中用此方法來防污染。Andersson等[22]將UNG處理與使用dUTP的預擴增相結合，為有效的消除污染、假陽性和不準確性提供了一種定量方法。Manajit等[23]采用尿嘧啶-DNA-糖基酶加環介導的恒溫擴增技術，結合納米金標記雜交探針(UDG-LAMP-AuNP)對銅綠假單胞菌進行檢測，該方法快速、簡便、特異，可用于銅綠假單胞菌污染樣品的鑒定。Fallahi等[24]用dUTP取代dTTP成功進行了LAMP反應。在下一步反應前，用UNG選擇性地裂解含有dUTP的LAMP產物，對含模板DNA無影響。這種改進的LAMP方法與UNG法處理相輔相成，可防止攜帶污染，為檢測植物病毒提供了一種方法。

UNG法一方面可以有效地消除污染，另一方面對不含尿嘧啶的天然DNA片段不起作用，有效地保護了新生擴增產物，但是在反應體系中引入dUTP會降低PCR的擴增效率，因此需要對酶的用量、反應時間等條件進行優化[25]。本試驗用3倍濃度dUTP取代dTTP，對沙門菌基因組DNA進行擴增，得到大量含尿嘧啶的U-DNA，將其作為后續試驗的陽性模板。進行PCR反應前在反應體系中引入UNG，對UNG的用量和反應時間進行優化。UNG可將污染的含尿嘧啶的U-DNA水解產生脫嘌呤嘧啶位點，失去模板的功能，而在預變性過程中被滅活而不影響PCR擴增。在陽性對照組中加入UNG抑制劑來抑制UNG的活性，以保證陽性模板的順利擴增，證明反應程序的正確性，并對抑制劑的用量和反應時間進行優化。最終建立的防污染方法為：在陽性對照的反應體系中加入1.5U UNG、2U UGI以及含有尿嘧啶的DNA(U-DNA)陽性模板；其他檢測樣品的反應體系中加入1.5U UNG，擴增體系所用的dNTP中以3倍濃度的dUTP代替dTTP，50 ℃保溫10 min，再25 ℃保溫15 min，然后再進行常規的PCR擴增，所有擴增產物均為含有尿嘧啶的U-DNA。試驗驗證結果表明，即使高濃度的U-DNA污染PCR反應體系，使用該方法也可以有效地防止污染，雖然模板量為1.0 μg和2.0 μg時仍有少量擴增，但是實際試驗操作中很少出現這么大的污染量。特異性和敏感性檢測結果顯示，通過酶量和反應時間的優化，本試驗建立的防污染PCR方法對于PCR的特異性和敏感性均無影響。

本試驗建立的方法能有效快速地消除污染，操作簡便，成本低，對實驗室環境和操作人員要求不高，且對PCR擴增反應無影響，能夠有效提高沙門菌PCR檢測的準確性，防止假陽性的出現，為食源性沙門菌的檢測提供了一種可靠的方法。